Die globale Transkriptomanalyse der Allopolyploidisierung zeigt große Ergebnisse

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 426 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Synthetische hexaploide Weizenlinien (SHW) werden als Keimplasma vor der Zucht erstellt, um das D-Subgenom von hexaploidem Weizen zu diversifizieren und die ungenutzte genetische Vielfalt des Aegilops tauschii-Genpools zu nutzen. Allerdings sind die im Ae beobachteten Phänotypen. Tauschii-Eltern werden in den SHW-Linien nicht immer gefunden, möglicherweise aufgrund von Interaktionen zwischen Subgenomen. Um dieses Phänomen der Neuprogrammierung des Genoms nach der Polyploidisierung aufzuklären, führten wir eine RNA-Sequenz von vier SHW-Linien und ihren entsprechenden tetraploiden und diploiden Eltern in zehn Geweben und drei biologischen Replikaten durch. Die HEB-Analyse (Homöolog Expression Bias) unter Verwendung von mehr als 18.000 Triaden deutet auf eine massive Unterdrückung von Homöoallelen des D-Subgenoms in SHWs hin. Eine vergleichende Transkriptomanalyse des gesamten Gensatzes des Genoms bestätigte diesen Befund weiter. Eine alternative Spleißanalyse der hochzuverlässigen Gene weist auf eine zusätzliche Komplexitätsebene hin, bei der alle fünf Spleißereignisse identifiziert werden und das beibehaltene Intron vorherrscht. Die homöologische Expression bei der Resynthese von hexaploidem Weizen hat Auswirkungen auf die Verwendung und Handhabung dieses Keimplasmas in der Züchtung, da sie sich auf die Erfassung der Auswirkungen der epistatischen Interaktion zwischen Subgenomen bei der Polyploidisierung bezieht. Dieses Keimplasma muss bei Vorzuchtaktivitäten besonders berücksichtigt werden, um das Ausmaß der Interaktionen zwischen den Subgenomen auf die Genexpression und ihre Auswirkungen auf Merkmale zur Verbesserung der Nutzpflanze zu berücksichtigen.

Ereignisse der Duplikation des gesamten Genoms sind einer der Haupttreiber der Artbildung1,2,3. Die Mehrzahl der Angiospermen hat im Laufe ihrer Evolution eine Polyploidisierung erfahren, und insbesondere gelten 30 % der Nutzpflanzenarten aufgrund des Ausmaßes duplizierter Loci in ihrem Genom als polyploid4. Die Graslinie durchlief mindestens drei Duplikationen des gesamten Genoms5, wodurch die gesamte Familie der Poaceae im Grunde polyploid wurde. Es wird häufig festgestellt, dass Ereignisse der Duplikation des gesamten Genoms mit einem erheblichen evolutionären Potenzial verbunden sind, das die Anpassungsfähigkeit an sich ändernde Umgebungen fördert6,7. Es gibt mehrere interessante Fragen im Zusammenhang mit Polyploiden, von den anfänglichen dynamischen Veränderungen, die sie im Genom zur Stabilisierung durchlaufen, bis zu ihrer Etablierung als eigenständige Populationen8. Polyploidisierung führt zu einer umfassenden Redundanz innerhalb des Genoms und ebnet so den Weg für neuartige Veränderungen, die die Entwicklung neuer Phänotypen und/oder Anpassungen fördern9.

Brotweizen (Triticum aestivum L.) ist eine allohexaploide Kulturpflanze (2n = 6x = 42), die aus den Subgenomen A, B und D besteht. Die natürlichen Zufallshybriden, die vor etwa 8000 Jahren zwischen kultiviertem Emmerweizen (Triticum turgidum L. ssp. dicoccum, 2n = 4x = 28; AABB-Genom) und Tausch-Ziegengras (Aegilops tauschii Coss., 2n = 2x = 14; DD-Genom) stattfanden , gefolgt von einer Chromosomenverdoppelung, führte zur Entwicklung des modernen Brotweizens10,11. Vermutlich nur eine begrenzte Anzahl von Ae. Tauschii-Pflanzen trugen zur Entwicklung des hexaploiden Weizens bei, was zu einem evolutionären Engpass führte, der als Gründereffekt bezeichnet wird12; Ein Engpass, der durch den begrenzten natürlichen Fluss genetischer Variationen von diploiden zu hexaploiden Arten13,14 und die anschließende Domestizierung und Zucht weiter verengt wurde.

Wildlebende Verwandte von Nutzpflanzenarten sind eine Quelle der genetischen Vielfalt für mehrere landwirtschaftlich wichtige Merkmale. Es gibt jedoch bestimmte Einschränkungen bei ihrer Verwendung, einschließlich Verbindungswiderstand, Unfruchtbarkeit und schlechter Kreuzkompatibilität15. Vorzüchtung ist ein systematischer Ansatz, der darauf abzielt, die genetische Vielfalt wildlebender Verwandter zurückzugewinnen und in Zuchtprogrammen einzusetzen. Traditionell werden die gewünschten genomischen Segmente von Wildpflanzenarten durch wiederholte Rückkreuzung mit Unterstützung modernster Werkzeuge zur Genotypisierung des gesamten Genoms für die Vordergrund- und Hintergrundselektion in Elite-Sortenhintergründe eingebracht. SHWs, die aus der künstlichen Hybridisierung zwischen T. turgidum ssp. Durum (AABB) oder andere Unterarten und Ae. Tauschii (DD), gefolgt von einer Chromosomenverdopplung, dienen als wirksame Vorzuchtpopulationen, um die genetische Vielfalt des D-Subgenoms von hexaploidem Weizen zu erweitern. SHWs, die vom International Maize and Wheat Improvement Center (CIMMYT, Mexiko)16,17 entwickelt wurden, wurden in mehreren Ländern umfassend in Programmen zur Anreicherung der genetischen Vielfalt von Weizen eingesetzt. Später produzierten auch andere Forschungsinstitute und Weizenverbesserungsprogramme auf der ganzen Welt SHWs unter Verwendung verschiedener Ae-Quellen. Tauschii-Akzessionen sollen als Basispopulationen für die kommerzielle Weizenzüchtung dienen.

Ae. Tauschii ist eine nachgewiesene Quelle der Resistenz gegen ein breites Spektrum biotischer und abiotischer Belastungen18. Allerdings werden die elterlichen Phänotypen in den synthetischen hexaploiden Linien nicht immer effektiv wiederhergestellt, möglicherweise aufgrund der dynamischen genetischen und epigenetischen Veränderungen und der daraus resultierenden Variation in der Genexpression19. Beispielsweise haben Studien der letzten zwei Jahrzehnte gezeigt, dass die Resistenz gegen den Stammrosterreger (Puccinia graminis f. sp. tritici) im hexaploiden Zustand durch Med15 unterdrückt wird, eine Komponente des Mediatorkomplexes, der vom D-Subgenom kodiert wird20,21. Bei der Polyploidisierung zeigt das D-Homöolog des hochaffinen K + Transporters 1;5 (HKT1;5) im Vergleich zu diploiden Elternniveaus eine verringerte Expression, erreicht jedoch unter Salzstressbedingungen das native Expressionsniveau der diploiden Eltern zurück22. Bei bestimmten Phänotypen, wie z. B. der Kornbreite, ist jeder der Homöologen unterschiedlich mit dem interessierenden Merkmal assoziiert und ihre kombinierten Expressionsniveaus bestimmen den resultierenden Phänotyp23.

Es wird auch angenommen, dass die Veränderung über mehrere Ebenen der Genregulation bei der Polyploidisierung die Anpassungsfähigkeit des allohexaploiden Brotweizens im Vergleich zu seinen tetraploiden und diploiden Eltern verbessert24,25. Die genetischen und epigenetischen Veränderungen, über die bei der Polyploidisierung bei Weizen berichtet wird, ähneln denen anderer polyploider Pflanzenarten. Auf struktureller Ebene wurden neben dem homöologen Austausch zwischen Genomen sowohl der Verlust als auch die Verstärkung repetitiver DNA aufgrund wahrgenommenen Genomstresses beobachtet26. Die jüngste Sequenzierung des gesamten Genoms von Brotweizen gibt Aufschluss über die Transposon-Insertionen und -Deletionen in den intergenischen Regionen der A-, B- und D-Subgenome, obwohl der Anteil jeder Transposon-Familie unter den homöologen Genomen nicht wesentlich variiert27. Auf epigenetischer Ebene wurden zusätzlich zu Veränderungen im Cytosin-Methylierungsstatus der DNA auch Variabilität in der Histon-Methylierung28,29, Euchromatin- und Heterochromatin-Mustern über Chromosomen hinweg sowie deutliche Unterschiede in der Menge epigenetischer Regulatoren wie kleinen RNAs beobachtet30,31. Diese epigenetischen Markierungen auf den regulatorischen Elementen des Genoms modulieren die Genexpressionsniveaus im hexaploiden Brotweizen32.

Die Auswirkungen einiger dieser genomischen und epigenomischen Veränderungen, die bei der Polyploidisierung auftreten, spiegeln sich im Transkriptom wider. Das Verständnis des Musters der Expressionsänderungen zwischen dem Hintergrund der elterlichen Ploidie und dem hexaploiden Weizen liefert wertvolle Informationen, um interspezifische Kreuzungen zu informieren und bei der Vorhersage der in den Nachkommen wiederhergestellten Phänotypen zu helfen. In dieser Studie verwendeten wir vier SHW-Linien und ihre entsprechenden tetraploiden (T. turgidum) und diploiden (Ae. tauschii) Eltern für eine vergleichende Bewertung der Transkriptomdynamik. Wir haben uns darauf konzentriert, die Veränderungen in den Expressionsmustern homöologer Gene zwischen den Subgenomen im elterlichen (2x und 4x) und synthetischen Hybridhintergrund (6x) aufzudecken. Zusätzlich zu den quantitativen Unterschieden wurden auch die subtilen qualitativen Unterschiede in den Transkripten ermittelt, die sich aus alternativen Spleißereignissen ergeben.

In diesem Experiment wurden RNA-seq-Daten aus vier SHW-Linien und ihren zwei diploiden und zwei tetraploiden Eltern (Ergänzungstabelle 1) aus drei biologischen Replikaten in zehn Geweben (Ergänzungsabbildung 1) für insgesamt 240 Proben generiert. Nach der Vorverarbeitung der Sequenzierungs-Reads für die 240 Proben erhielten wir insgesamt 4,9 B-Reads, was einem Durchschnitt von 20,4 M Reads pro Probe entspricht, im Bereich von 4,8 bis 70,7 M. Die Anzahl der Roh-Reads und verarbeiteten Reads für jede Probe wurde zusammengestellt (Ergänzungstabellen 2, 3). Ungefähr 85 % der gesamten Lesevorgänge wurden eindeutig dem Chinese Spring IWGSC RefSeq v2.133 zugeordnet, etwa 12 % wurden mehreren Loci zugeordnet und etwa 3 % wurden überhaupt nicht zugeordnet (Ergänzungstabelle 4).

Um das globale Muster der Genexpressionsdynamik bei Polyploidisierung, insbesondere HEB, zu verstehen und sie zwischen SHWs und ihrem Elternzustand zu vergleichen, wurden Gene (Homöologen) herangezogen, die zu Triaden gehören, d. h. mit einer Kopie in allen drei Subgenomen (18.357 Triaden34). ), wurden der Berechnung des Likelihood-Ratio-Tests35 (LRT) unterzogen. Hierbei werden die Unterschiede in der Genlänge zwischen den Homöologen berücksichtigt. Für alle Vergleiche wurde die Nullhypothese getestet, also keine Expressionsunterschiede zwischen den Homöologen. In den SHW-Linien wurden die AB- und D-Homöologen verglichen. Um den elterlichen Ausdruckszustand zu testen, wurden in silico SHW-ähnliche Szenarien mit entsprechenden tetraploiden und diploiden elterlichen Ausdrucksstufen erstellt. In allen zehn Geweben und SHWs wurden Expressionsverzerrungen beobachtet, die im elterlichen Expressionsniveau überwiegend auf das D-Subgenom ausgerichtet waren (Abb. 1). Die Anzahl der Triaden, die eine signifikante Verzerrung des vom diploiden (D) Elternteil beigesteuerten Subgenoms zeigten, wurde in den entsprechenden SHW-Linien in allen Geweben drastisch reduziert (Abb. 1 und Ergänzungstabelle 5). Das Stempelgewebe, als die Staubbeutel grün und unreif waren, wies mehr als 10.000 Triaden auf, die auf das D-Subgenom ausgerichtet waren, basierend auf den Expressionsniveaus der Eltern in allen vier SHWs. Die beim Booten gesammelten Köpfe zeigten bei allen SHWs außer C44 ein ähnliches Muster (Abb. 1).

Die dunkelblauen und dunkelorangen Balken stellen die Anzahl der Triaden dar, die eine signifikante Expressionsverzerrung in Richtung AB- bzw. D-Subgenome aufweisen. Stempel-1DAA-Stempel – einen Tag nach der Blüte, Stempel-AM-Stempel – wenn die Staubbeutel im reifen Stadium sind, Stempel-AI-Stempel – wenn die Staubbeutel im unreifen Stadium sind, Stiefelkopf im Stiefelstadium.

Im Sprossgewebe von SHW-C66 zeigten die Triaden 9978 und 808 eine signifikante Tendenz zu den D- bzw. AB-Subgenomen, basierend auf dem elterlichen Expressionsgrad. Im SHW-Hintergrund waren jedoch nur 890 Triaden auf das D-Subgenom ausgerichtet (Abb. 2a, b). In Staubbeuteln waren 5667 und 1115 Triaden in der Vorläuferexpressionsebene auf die D- bzw. AB-Subgenome ausgerichtet und im hexaploiden Zustand mit 1740 D- und 1841 AB-basierten Triaden ausgeglichener (Abb. 2c, d). Ebenso wurden 10.128 Triaden, die in den Expressionsniveaus der Eltern auf das D-Subgenom ausgerichtet waren, in den Stempeln (gesammelt, als die Staubbeutel grün und unreif waren) von SHWs auf 2976 reduziert (Abb. 2e, f). Diese Ergebnisse veranschaulichen große Verschiebungen in der Expressionsverzerrung zwischen Hunderten von Gensätzen zwischen dem Szenario ohne Interaktion, dh dem elterlichen Expressionszustand, und der groß angelegten Genexpressionsveränderung, die durch Interaktionen der Subgenome verursacht wird, dh in SHW-Linien. Die Anzahl der Triaden, die signifikant auf das D-Subgenom ausgerichtet waren, war im elterlichen genomischen Hintergrund höher als bei ihrer Expression, als sie in den synthetischen hexaploiden Hintergrund eingeführt wurden. Die Verteilung des HEB für die anderen sieben Gewebe für SHW-C66 ist in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 2–8.

(a, c, e) Vergleich der Expressionsverzerrung von Triaden gegenüber AB- und D-Genomen von tetraploiden (PI377655) und diploiden (AS2386) Eltern; (b, d, f) Vergleich der Expressionsverzerrung von Triaden gegenüber AB- und D-Subgenomen von SHW-C66; (a, b) Schießen; (c, d) Reifer Staubbeutel kurz vor der Dehiszenz; (e, f) Stempel, wenn die Staubbeutel grün und unreif sind. Die dunkelblauen und dunkelorangen Balken stellen die Triaden dar, die eine signifikante Expressionsverzerrung in Richtung AB- bzw. D-Subgenome zeigen.

Im In-silico-Szenario ohne vorhergesagte Interaktion war der Anteil der Triaden, die auf das D-Genom ausgerichtet waren, mindestens 1,5-fach (LogFC 0,6) höher als der Anteil der Triaden, die auf das AB-Genom ausgerichtet waren, wie im Sprossgewebe von SHW-C45 beobachtet wurde, und mehr bis 27-fach (LogFC 4,8) höher, wie im Kopfgewebe von SHW-C66 im Stiefelstadium beobachtet (Abb. 3). Allerdings war diese Zahl im tatsächlichen hexaploiden Hintergrund drastisch reduziert und eine nahezu gleiche Anzahl von Triaden war auf die Subgenome beider Eltern (AB und D) ausgerichtet. Im Gegenteil, die Triaden, die eine Expressionsverzerrung in die entgegengesetzte Richtung zeigten, dh eine Tendenz zum AB-Genom, nahmen in den meisten Geweben der SHWs zu, wobei die stärkste HEB in der SHW-Linie C44 beobachtet wurde (Abb. 3).

Die Verhältnisse werden als Log-Fold-Change-Werte (LogFC) dargestellt. Ein LogFC < 0 zeigt an, dass innerhalb eines genomischen Hintergrunds mehr Triaden auf das AB-Subgenom als auf das D-Subgenom ausgerichtet sind, und ein LogFC > 0 zeigt an, dass mehr Triaden auf das D-Subgenom als auf das AB-Subgenom ausgerichtet sind. C44, C45, C65 und C66 sind die vier SHWs, die für die Studie verwendet wurden. Die grünen Balken repräsentieren die Verhältnisse im elterlichen genomischen Hintergrund und die blauen Balken repräsentieren den SHW-Genomhintergrund. Stempel-1DAA-Stempel – einen Tag nach der Blüte, Stempel-AM-Stempel – wenn die Staubbeutel im reifen Stadium sind, Stempel-AI-Stempel – wenn die Staubbeutel im unreifen Stadium sind, Stiefelkopf im Stiefelstadium.

Die Analyse der Trends innerhalb desselben Subgenomhintergrunds ergab, dass die auf das AB-Subgenom ausgerichteten Triaden im hexaploiden Zustand zahlreicher waren als im Elternzustand (Abb. 4). Alle Gewebe von SHW-C44 wiesen einen erhöhten Anteil an Triaden auf, die eine Expressionsverzerrung in Richtung des AB-Subgenoms zeigten, wobei bis zu 7,9-fach (LogFC 2,98) mehr Triaden im Hypokotylgewebe überexprimiert wurden. In den anderen drei SHW-Linien betrug die Zunahme der auf das AB-Subgenom ausgerichteten Triaden das bis zu 5,2-fache (Kopf im Boot-Stadium von C66; LogFC 2,37). Der Anteil der auf das D-Subgenom ausgerichteten Triaden wurde in mehreren SHW-Gewebekontexten um mehr als das Achtfache reduziert.

Die Verhältnisse werden als Log-Fold-Change-Werte (LogFC) dargestellt. Ein LogFC > 0 zeigt an, dass im SHW-Hintergrund mehr Triaden auf das AB-Subgenom ausgerichtet sind als auf den elterlichen Hintergrund, und ein LogFC < 0 zeigt an, dass im elterlichen Hintergrund mehr Triaden auf das AB-Subgenom ausgerichtet sind als auf den SHW, ähnlich für das D-Subgenom. C44, C45, C65 und C66 sind die vier SHWs, die für die Studie verwendet wurden. Die dunkelblauen und dunkelorangen Balken stellen die Triaden dar, die eine signifikante Expressionsverzerrung in Richtung AB- bzw. D-Subgenome zeigen. Stempel-1DAA-Stempel – einen Tag nach der Blüte, Stempel-AM-Stempel – wenn die Staubbeutel im reifen Stadium sind, Stempel-AI-Stempel – wenn die Staubbeutel im unreifen Stadium sind, Stiefelkopf im Stiefelstadium.

Die durchschnittliche Größe der HEB-Werte für die AB- und D-voreingenommenen Triaden für die SHW- und elterlichen Hintergrundszenarien ist in der Ergänzungstabelle 5 zusammengefasst. Für die AB-voreingenommenen Triaden lag die Größe der HEB-Werte im Bereich von –1,17 (C65 – Stempel, wenn Staubbeutel vorhanden sind). grün und unreif) bis −4,37 (C44 – Hypokotyl), im SHW-Hintergrund. Die Größe des HEB der AB-voreingenommenen Triaden variierte im elterlichen Hintergrund von –1,22 (C65 – Kopf im Startstadium) bis –3,56 (C66 – Kopf im Startstadium). In ähnlicher Weise reichte die Größe der HEB-Werte der D-voreingenommenen Triaden von 1,16 (C44 – Stempel, wenn die Staubbeutel grün und unreif sind) bis 3,12 (C45 – Hüllspelze) im SHW-Hintergrund und von 1,32 (C45 – Kopf im Stiefelstadium). bis 4,66 (C45 – Aufnahme), im Elternhintergrund. Die durchschnittliche Größe der HEB-Werte der AB-beeinflussten Triaden war in allen SHW-Gewebeszenarien höher als die der D-beeinflussten Triaden, mit Ausnahme des C65-SHW-Hintergrunds im Stempel, wenn die Staubbeutel grün und unreif sind. Im elterlichen Hintergrund wurde jedoch kein festes Muster beobachtet (Ergänzungstabelle 5).

Die Untergruppe der Triaden, die über verschiedene SHW-Linien hinweg ähnliche Ausdrucksverzerrungsmuster aufwiesen, wurde ebenfalls analysiert. Die Schnittpunkte zwischen den vier SHW-Linien und zwischen den SHW-Linien mit gemeinsamen tetraploiden oder diploiden Eltern sind in Abb. 5 für das Sprossgewebe dargestellt. Der größte Schnittpunkt stellte die Teilmenge dar, die in allen vier SHW-Linien keine signifikante Verzerrung aufwies, und dies galt für alle zehn Gewebe (Abb. 5; ergänzende Abbildungen 9–17). Sprossgewebe wies die kleinste Untergruppe von Triaden auf, die über die vier SHW-Linien hinweg eine ähnlich signifikante Expressionsverzerrung in Richtung der Subgenome AB (228 Triaden) und D (242 Triaden) aufwiesen (Abb. 5). Der größte Schnittpunkt zwischen den SHW-Linien wurde im Stempel gefunden, wenn die Staubbeutel grün und unreif sind (Ergänzende Abbildung 15) und im Stempel – einen Tag nach der Blüte, für die AB-voreingenommenen (1281) bzw. D-voreingenommenen (1066) Triaden ( Ergänzende Abbildung 9).

Die grauen horizontalen Balken unter der eingestellten Größe, die C44AB entspricht, geben die Anzahl der Triaden an, die im SHW-C44 auf das AB-Subgenom ausgerichtet sind. C44D gibt die Anzahl der Triaden an, die im SHW-C44 auf das D-Subgenom ausgerichtet sind. C44UN gibt die Anzahl der Triaden an, die im SHW-C44 keine signifikante Verzerrung aufweisen; Ebenso für die SHWs C45, C65 und C66. Die vertikalen Balken unter der Schnittpunktgröße geben die Anzahl der Triaden an, die zwischen Sätzen ähnliche Ausdrucksmuster aufweisen. Die schwarzen Punkte markieren die beiden SHW-Sätze, die für den entsprechenden Schnittpunkt verglichen werden. Die Zahl über den Balken stellt die Anzahl der Dreiklänge dar, die ähnliche Ausdrucksmuster aufweisen. Die Triadensätze, die eine signifikante Tendenz zu den AB- oder D-Subgenomen aufweisen, und diejenigen, die keine signifikante Tendenz aufweisen, werden durch die blauen, grünen bzw. braunen Rechtecke hervorgehoben.

Von den 18.357 Triaden, die hinsichtlich des Expressionsmusters analysiert wurden, bestanden 69 % bis 73 % in allen vier SHW-Linien überhaupt nicht aus gewebespezifischen Homöologen (Ergänzungstabelle 6). Die nächstgrößten Fraktionen waren Triaden, bei denen alle drei Homöologen die gleiche gewebespezifische Expression zeigten (8 % bis 11 %), und Triaden, bei denen nur ein Homöologe eine Gewebespezifität zeigte, während die anderen beiden eine breitere Expression zeigten (7 % bis 12 %). Darüber hinaus gab es mehr Triaden mit zwei Homöologen, die eine Expressionsspezifität gegenüber demselben Gewebe zeigten, und einem breit exprimierten Homöologen, als ein Homöologe allein, der eine Expressionsspezifität in einem anderen Gewebe zeigte (Ergänzungstabelle 6).

Eine ähnliche Konstitution wurde in einzelnen SHW-Gewebekontexten beobachtet, am häufigsten, wobei nur einer der drei Homöologen gewebespezifisch war oder alle drei Homöologen Gewebespezifität zeigten (Ergänzungstabelle 7). Die Triaden, bei denen nur zwei der drei Homöologen Gewebespezifität zeigten, waren in allen zehn Geweben aller vier SHW-Linien zahlreich am geringsten. Im Wurzel- und reifen Antherengewebe war die Untergruppe der Triaden, die aus allen Homöologen mit Gewebespezifität bestand, in allen vier SHW-Linien am größten. Von den größeren Untergruppen der Triaden, bei denen alle drei Homöologen die gleiche Gewebespezifität zeigten, waren 455 Triaden in der Wurzel in allen vier SHW-Linien gemeinsam. Als die Homöologen dieser Triaden einer genontologischen Analyse unterzogen wurden, um die funktionelle Anreicherung zu verstehen, wurden biologische Prozessbegriffe, einschließlich der Regulierung der Wurzelmorphogenese und der Regulierung des Wurzelmeristemwachstums, in der Wurzel angereichert. In reifen Staubbeuteln betrug diese Zahl 427 und die Begriffe des biologischen Prozesses, einschließlich Pollenkeimung, Pollenspermiendifferenzierung, Pollenschlauchwachstum und Pollenwandaufbau, wurden angereichert.

Eine große Anzahl von Triaden, bestehend aus einem, zwei oder drei gewebespezifischen Homöologen, zeigte keine signifikante Expressionsverzerrung, ähnlich der Beobachtung im gesamten Triadendatensatz. Bei der spezifischen Befragung der Triaden mit AB- und D-Bias und ihrer Gewebespezifitätsmuster wurde in den meisten Geweben insgesamt eine moderate Stärke der Assoziation mit der Cramer-V-Statistik zwischen 0,20 und 0,57 zwischen Bias-Muster und Gewebespezifität der Homöologen beobachtet vier SHW-Linien. Beispielsweise zeigten mehr Triaden eine D-Subgenom-Verzerrung, wenn D-Homöolog allein gewebespezifisch war, eine größere Anzahl AB-verzerrter Triaden wurde beobachtet, wenn A- und B-Homologe Gewebespezifität zeigten, und mehr D-verzerrte Triaden wurden beobachtet, wenn A und D oder B- und D-Homöologen allein zeigten in den meisten SHW-Gewebekontexten Gewebespezifität. Basierend auf dem Chi-Quadrat-Unabhängigkeitstest war der Zusammenhang zwischen Expressionsbias und Gewebespezifität jedoch nur in reifen Staubbeutel-, Wurzel- und Hypokotylgeweben in allen vier SHW-Linien signifikant, und C66 zeigte zusätzlich einen signifikanten Zusammenhang im Stempel – einen Tag nach der Anthese. Stempel – wenn die Staubbeutel grün und unreif sind und C44 in allen Geweben eine signifikante Assoziation zeigte. Obwohl das beobachtete Ausmaß der Assoziationen moderat war, kann der Zusammenhang zwischen der Gewebespezifität der Homöologen und der Expressionsverzerrung nicht ausgeschlossen werden.

Um die beobachteten Muster in stabileren Genomen zu validieren, wurde der Expressionsbias in Weizenlinien analysiert, die Domestizierungs- und Zuchtprozessen unterzogen wurden, wobei die öffentlich verfügbaren RNA-seq-Daten für die Landrasse Chinese Spring und die Sorte Azhurnaya von Ramírez-Gonzalez et al. verwendet wurden. 36. Die Anzahl der HEB und das Ausmaß der Expressionsverzerrungen waren bei diesen Genotypen im Vergleich zu den SHW-Linien viel geringer (Abb. 6). In Azhurnaya waren in den in Abb. 6 dargestellten Geweben 2087 bis 4244 Triaden auf das AB-Subgenom und 2032 bis 3739 Triaden auf das D-Subgenom ausgerichtet. Im chinesischen Frühling waren 874 bis 4512 Triaden auf das AB-Subgenom und 812 auf das D-Subgenom ausgerichtet 3821 Triaden waren in den fünf in der Analyse verwendeten Geweben auf das D-Subgenom ausgerichtet. Das Ausmaß der Verzerrungen war bei den beiden domestizierten Weizenlinien geringer als bei den neu geschaffenen SHW-Linien.

Die Verhältnisse werden als Log-Fold-Change-Werte (LogFC) dargestellt, die durch die blauen Balken dargestellt sind. Ein LogFC < 0 zeigt an, dass mehr Triaden auf das AB-Subgenom als auf das D-Subgenom ausgerichtet sind, und ein LogFC > 0 zeigt an, dass mehr Triaden auf das D-Subgenom als auf das AB-Subgenom ausgerichtet sind.

Der Einfluss von Domestikations- und Brutprozessen auf die HEB-Muster der Triaden wurde anhand der Ergebnisse von SHW, Chinese Spring und Azhurnaya analysiert. Drei unserer SHW-Gewebe konnten den Entwicklungsstadien der Proben von Ramírez-Gonzalez et al.36 zugeordnet werden, nämlich Stempel, wenn die Staubbeutel reif sind, Wurzel und Kopf im Stiefelstadium, und wurden in dieser Analyse verwendet. Die Mehrheit der Triaden (29–55 %) behielt in allen drei Geweben ähnliche Expressionsverzerrungsmuster im resynthetisierten Weizen, der Landrasse (Chinese Spring) und der Sorte (Azhurnaya) bei (ergänzende Abbildung 18). Nur 9–14 % zeigten ähnliche Bias-Muster im SHW und im Chinese Spring und wechselten in Azhurnaya in einen anderen Bias-Zustand, was möglicherweise auf die Auswirkungen einer strengen Auswahl zurückzuführen ist. Darüber hinaus zeigten 9–30 % der Triaden, basierend auf den verschiedenen SHW-Gewebeszenarien, eine Umkehr des SHW-Bias-Zustands in Azhurnaya (ergänzende Abbildung 18). Unter Berücksichtigung der HEB-Unterschiede für die Triaden zwischen den SHW-Linien haben wir auch speziell die Teilmenge der Triaden untersucht, die über alle vier SHW-Linien hinweg ähnliche Bias-Muster aufweisen. Der Großteil der Triaden in dieser Untergruppe behielt die gleichen Ausdrucksverzerrungsmuster in den SHWs, Chinese Spring und Azhurnaya bei, und der zweitgrößte Anteil zeigte ähnliche Muster in den SHWs und Azhurnaya und nicht in Chinese Spring, was auf die Umkehr der Bias-Muster während der Ernte hinweist Verbesserung. Der Dreiklang, der ähnliche Musterwechsel aufwies, darunter „Chinesischer Frühling“ und „Aschurnaja“, war der kleinste.

Die HEB-Expressionsanalyse in zehn verschiedenen Geweben ermöglichte die Untersuchung von Bias-Mustern der Triaden in verschiedenen Geweben, dh über die Entwicklungsstadien hinweg. In allen vier SHW-Linien bestand das größte beobachtete Muster aus Triaden, die in keinem Gewebe eine signifikante Abweichung zeigten. Es gab zwischen 1449 und 3014 Triaden in den SHW-Linien, die dieses Muster zeigten (Abb. 7, ergänzende Abb. 19). In allen vier SHW-Linien war der am zweithäufigsten beobachtete Bias-Trend, dass die Triaden in keinem der Gewebe eine signifikante Bias zeigten, sondern nur in den reifen Staubbeutelgeweben in Richtung der AB- oder D-Subgenome tendierten (Abb. 7, ergänzende Abb. 19). In mehreren Triaden wurden Muster beobachtet, die nur eine signifikante Abweichung in einem der Gewebe zeigten, z. B. im Stempel – einen Tag nach der Blüte, im Stempel, wenn die Staubbeutel grün und unreif sind und Wurzeln schlagen. Darüber hinaus gab es Tausende von Triaden-spezifischen Mustern in allen Geweben. Ähnliche Trends wurden auch in Azhurnaya beobachtet, und die Untergruppe der Triaden, die eine signifikante Abweichung im Antherengewebe zeigten, war größer, während im Chinesischen Frühling Triaden häufig vorkamen, die eine signifikante Abweichung nur im Spitzengewebe zeigten.

Alluviale Diagramme, die die Expressions-Bias-Trends der Triaden in den Geweben in (a) SHW-C66 (b) Landrasse Chinese Spring und (c) Cultivar Azhurnaya darstellen; AB-Bias (AB), dargestellt durch marineblaue Balken: Triaden, die deutlich auf das AB-Subgenom ausgerichtet sind; D-Bias (D), dargestellt durch dunkelorangefarbene Balken: Triaden, die deutlich auf das D-Subgenom ausgerichtet sind; Nicht ausgedrückt (NE), dargestellt durch grüne Balken: Die Homöologen der Triaden werden nicht ausgedrückt; Unvoreingenommen (UN), dargestellt durch graue Balken: Es wurde kein signifikanter Ausdrucksfehler beobachtet.

Darüber hinaus wurde die unterschiedliche Expressionsanalyse des gesamten Gensatzes zwischen den Eltern und SHWs untersucht. In der Analyse wurden die 106.913 Genmodelle mit hoher Konfidenz verwendet, die im hexaploiden Weizengenom gemäß der IWGSC RefSeq-Annotation v2.133 identifiziert wurden. In den Genen aus den A- und B-Subgenomen waren in den SHWs im Vergleich zu ihren tetraploiden Eltern in SHW-C44 nur wenige hundert bis maximal 1015 Gene herunterreguliert (Abb. 8). Im Gegensatz dazu waren in allen SHWs im Vergleich zu ihren diploiden Eltern mehr als 20.000 D-Subgenom-Gene herunterreguliert (Abb. 8). Am wichtigsten ist, dass in allen drei Subgenomen nur 357 bis 755 Gene und 141 bis 372 Gene im AB- bzw. D-Subgenom eine Hochregulierung im hexaploiden Zustand aufwiesen.

Die blauen Balken stellen die Anzahl der herunterregulierten Gene dar und die gelben Balken stellen die Anzahl der hochregulierten Gene dar.

Die RNA-seq-Daten wurden auch ausgewertet, um die Unterschiede in den Spleißmustern auf den verschiedenen Ploidieniveaus zu charakterisieren und so Aufschluss über die qualitativen Unterschiede zwischen den Transkripten zu geben. Diese Analyse erfasste die Spleißvarianten aller Gene, unabhängig davon, ob sie differentiell exprimiert wurden oder nicht. Fünf Haupttypen alternativer Spleißereignisse, nämlich sich gegenseitig ausschließende Exons (MXE), alternative 3′-Spleißstelle (A3SS), alternative 5′-Spleißstelle (A5SS), beibehaltenes Intron (RI) und übersprungenes Exon (SE), wurden untersucht (Abb. 9). Als Beispiel ist die Anzahl der in jedem Genotyp nachgewiesenen statistisch signifikanten alternativ gespleißten RNA-Isoformen für Sprossgewebe in den Facetten des gestapelten Balkendiagramms dargestellt (Abb. 10a, b). Zurückgehaltenes Intron war das häufigste alternative Spleißereignis (34,2–79,5 %), und sich gegenseitig ausschließende Exons wurden in allen Szenarien am seltensten erkannt (0–7,3 %). Die reifen Staubbeutel und der Stempel – wenn die Staubbeutel grün und unreif sind – zeigten im Vergleich zu anderen Geweben die wenigsten alternativen Spleißereignisse. Die Anzahl der in den anderen neun Geweben erkannten alternativ gespleißten Ereignisse ist in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 20–28. Unter den mehrfach erkannten alternativ gespleißten Ereignissen entsprachen 69–78 % homöologen Genen in Triaden (Abb. 10c und ergänzende Abb. 20–28). In allen Vergleichen waren mehr alternative Spleißereignisse mit D-Homöologen verbunden, außer im Sprossgewebe von C45 im Vergleich zu den Eltern, wo ein gleicher Anteil an Ereignissen mit allen drei Subgenomen assoziiert war (Abb. 10c und ergänzende Abb. 20–28). Insgesamt wurde in SHW-Linien eine groß angelegte quantitative Repression des D-Subgenoms beobachtet, gemessen anhand homöologer Expressionsverzerrungen, und auch qualitative Veränderungen waren in diesem Subgenom stärker ausgeprägt, wie die größere Darstellung alternativer RNA-Spleißereignisse zeigt.

(a) Alternative 3′-Spleißstelle; (b) Alternative 5'-Spleißstelle; (c) sich gegenseitig ausschließende Exons; (d) behaltenes Intron; (e) Übersprungenes Exon. Die roten Diagramme stellen die Ae dar. tauschii C26-Elterntranskripte und die gelben Diagramme repräsentieren die SHW-Linien-C66-Transkripte.

(a) Diploider Elternteil vs. SHW-Linie; (b) Tetraploider Elternteil vs. SHW. Sich gegenseitig ausschließende MXE-Exons, A3SS alternatives 3'-Spleißen, A5SS alternatives 5'-Spleißen, RI behaltenes Intron, SE übersprungenes Exon, LA Langdon, PI PI377655; (c) Anteil alternativer Spleißereignisse, an denen die Homöologen in Triaden und anderen Genen beteiligt sind.

Der Prozess der Introgression wünschenswerter neuer Allele und Haplotypen, die den Phänotypen genetisch unterschiedlicher Eltern zugrunde liegen, bekannt als Vorzüchtung, ist eine praktikable Strategie zur Entwicklung von Sorten mit verbesserter Krankheitsresistenz, Qualität und agronomischen Merkmalen, einschließlich Klimaresilienzmerkmalen. Hybridisierungen zwischen verschiedenen Eltern führen jedoch häufig zu einer schlechten Penetranz und Ausdruckskraft der Merkmale, die von Spendereltern stammen. SHWs werden generiert, um auf die im Ae vorhandene genetische Vielfalt zuzugreifen. tauschii-Genpool (D-Genomspender) zur Überwindung dieses Alleldiversitätsengpasses bei Brotweizen, wobei über eine schlechte Wiederherstellung der Elternmerkmale berichtet wurde, wenn sich ihr genomischer Hintergrund von diploid (DD) zu hexaploid (AABBDD) ändert19. Daher ist ein kritisches Verständnis der genomweiten Auswirkungen der Polyploidisierung bei Nutzpflanzenarten erforderlich, um Strategien zur Verbesserung des Potenzials der Vorzüchtung zu entwickeln. In dieser Studie untersuchten und entschlüsselten wir die globalen Veränderungen des Expressionsniveaus in SHW-Linien und ihren entsprechenden tetraploiden und diploiden Vorläufern, um die Transkriptomdynamik darzustellen, die während anfänglicher Polyploidisierungsereignisse stattfindet. Die vier in der Studie verwendeten Eltern waren unterschiedlicher geografischer Herkunft. Insbesondere T. turgidum cv. Langdon stammt aus Nordamerika (Langdon) und PI377655 stammt aus dem ehemaligen Jugoslawien, während Ae. tauschii AS2386 und AS2399 stammen aus dem Iran37,38. Die im Experiment verwendeten primären SHW-Pflanzen waren seit mindestens vier Generationen selbstbestäubt; Diese Selfings erleichterten möglicherweise die Stabilisierung des Genoms im Vergleich zu entstehenden Polyploiden39 und ermöglichten die Erfassung vererbbarer transkriptomischer Variationen.

Die Triaden-Gensätze (Gene, die in ABD-Homöologen-Chromosomen im Verhältnis 1:1:1 vorliegen) bilden den lebenswichtigen Teil des Weizengenoms und spielen wichtige funktionelle Rollen, während die Gene, die als andere Variationen der homöologen Kopienzahl vorliegen, andere Funktionen erfüllen40. In allen zehn entwicklungsbedingt unterschiedlichen Geweben in den vier SHW-Linien war der Großteil der Gene aus dem D-Subgenom in SHWs im Vergleich zu ihren elterlichen Expressionsniveaus unterdrückt. Li et al.41 haben in ihrer Transkriptomanalyse von resynthetisiertem Weizen auch die Verschiebung der Expressionsdominanz beim Vergleich des Eltern- und Hexaploidzustands gezeigt. Veränderungen in der Expressionsverzerrung zwischen Homöologen bei der Vervielfältigung des gesamten Genoms wurden bei anderen allopolyploiden Nutzpflanzen nach der Resynthese beobachtet, darunter bei Raps42 und Baumwolle43, was auch die Subgenomdominanz bei diesen Arten widerspiegelt. Bei Brotweizen wurde jedoch vorgeschlagen, dass ein Gleichgewicht zwischen den Subgenomen vorherrscht, ohne dass es zu einer Dominanz der Subgenome kommt34,40. Dennoch wurde über eine gewebe-, wachstumsstadiums- und umweltbedingte Dominanz als Ursache für Entwicklungsprozess- und Umweltanpassungen berichtet44,45. In dieser Studie, die auf den Beobachtungen in den SHW-Linien basiert, wird die Dominanz des Expressionsniveaus in den Elternstadien durch Polyploidisierung reduziert, wodurch der Evolutionsprozess in Richtung eines insgesamt ausgeglichenen Allohexaploids gesteuert wird, während die homöologspezifische Variabilität durch die Entwicklung oder Umwelt genutzt wird Anforderungen. Bei domestizierten Weizengenotypen wurde festgestellt, dass die Expression von D-Homöologen weniger unterdrückt ist als die der A- und B-Homöologen36,40. Daher kann davon ausgegangen werden, dass die anfängliche weitreichende repressive Wirkung auf D-Homöologen darin besteht, ein Gleichgewicht in der Expression zwischen Genomen herzustellen, die von verschiedenen Eltern (AB und D) stammen, und nicht in der Unterwerfung des D-Subgenoms. Darüber hinaus bleiben die in neu synthetisierten Polyploiden etablierten Expressions-Bias-Muster über mehrere Generationen hinweg durch die Prozesse der Domestizierung und Zucht erhalten, wie in den RNA-seq-Daten von stabileren Genomen wie Chinese Spring (eine Landrasse) und Azhurnaya (eine Sorte) beobachtet. , bezogen auf die Open-Source-Datenbanken von Ramírez-Gonzalez et al.36. Daher werden die anfänglichen neuartigen Expressionsmuster (Unterdrückung des D-Subgenoms), die in neu synthetisiertem hexaploiden Weizen beobachtet werden, stabilisiert und über mehrere Generationen vererbt.

Polyploidisierungsereignisse beinhalten eine Neuordnung des Genoms und können die Gendosis entweder unmittelbar nach der Duplikation oder über einen langen Zeitraum (Millionenjahre) während der Evolution verändern46. Hier zeigten wir die unmittelbaren Auswirkungen (innerhalb von fünf Generationen nach der Selbstbefruchtung seit der ersten Kreuzung) der Polyploidisierung in hexaploiden Weizen. Die Verschiebung des Expressionsgleichgewichts kann auf die Gendosis (Allelkopien) zurückgeführt werden, da die biologisch signifikante Stöchiometrie von Makromolekülkomplexen und regulatorischen Genen, die sich auf stromabwärts gelegene Loci auswirken, für die Fitness eines Organismus von entscheidender Bedeutung sind47. Der Unterschied in der Expressionsverzerrung derselben Gensätze zwischen Geweben kann auf den Expressionsbeitrag der Duplikate zurückgeführt werden, die sich in einem gewebespezifischen Muster, insbesondere in den Fortpflanzungszellen, unterscheiden können48,49. Bemerkenswert ist, dass fünf der zehn in der Studie verwendeten Gewebe möglicherweise einen höheren Anteil haploider gametophytischer Zellen aufwiesen, die als Reproduktionspool bezeichnet werden. In einer weiteren Dimension erhöhen Polyploidisierungsereignisse die Komplexität des Genregulationsnetzwerks durch die Einführung intergenomischer Transregulationsmechanismen50. Dies könnte zu einer homöoallelspezifischen Expression führen, wie sie in früheren Studien in Weizen45 (2n = 6x = 42), hochploidiem Zuckerrohr51 (2n = 8x–12x = 80–120) und Erdnuss52 (2n = 4x = 40) beobachtet wurde. Darüber hinaus können der individuelle Entwicklungszustand der Pflanze und der Genotyp auch einen Einfluss auf die Allelspezifität haben51,53, was die Variation der Homöoallel-Expression in den zehn in der Entwicklung unterschiedlichen Geweben und vier genetisch unterschiedlichen SHW-Linien, die in unserer Untersuchung verwendet wurden, weiter erklärt.

Die Genexpressionsdynamik ist die translatorische Komponente, die die beobachtete phänotypische Variation und den zugrunde liegenden Genotyp verknüpft. Mehrere Triaden, die ähnliche Ausdrucksverzerrungsmuster in den SHWs, Chinese Spring und Azhurnaya, zeigen, weisen darauf hin, dass diese Untergruppe von künstlicher Selektion unberührt bleibt. Die anderen Triaden mit sich verändernden HEB-Mustern im resynthetisierten, domestizierten und Elite-Weizenhintergrund implizieren die Selektion spezifischer Expressions-Bias-Muster während der Domestikation und Ernteverbesserung, die möglicherweise mit anderen Genen gekoppelt sind, die die Eigenschaften des modernen Brotweizens regulieren. Die Einschränkung dieses Vergleichs besteht darin, dass die in der Studie verwendeten SHW-Linien nicht die direkten Vorfahren von Chinese Spring oder Azhurnaya sind und die Expressionsdaten aus verschiedenen Studien stammen. Daher wird eine weitere Befragung mehrerer Weizenlandrassen und Elite-Weizensorten mehr Licht auf die Selektion für HEB werfen.

Bei der Untersuchung der Bias-Trends der Triaden über die Gewebe hinweg war die Anzahl der Triaden, die in allen Geweben ein unverfälschtes Expressionsmuster zeigten, am größten, was mit der Beobachtung übereinstimmt, dass große Untergruppen der Triaden keine signifikante Bias in allen vier SHW-Linien in allen zehn Geweben zeigten. Bei Weizen und allopolyploider Baumwolle wurde über HEB berichtet, das für die Reaktion auf biotischen45 und abiotischen54 Stress spezifisch ist. Die Ergebnisse dieser Studie, die ein Überwiegen triadenspezifischer Bias-Trends über Entwicklungsstadien hinweg zeigen, deuten auf die räumliche und zeitliche Variabilität von HEB hin, die zusätzlich zu Stressreaktionsmustern zu unterschiedlichen Bias-Trends über Entwicklungsstadien hinweg führt. Bei allopolyploider Baumwolle zeigte eine Studie zur Analyse der Faserentwicklung die Veränderungen in der Chromatinarchitektur in den verschiedenen Entwicklungsstadien und deren Einfluss auf Genregulationsnetzwerke (GRNs), die zu HEB55 führen. Dies unterstreicht die mögliche Rolle dynamischer Variationen in der 3D-Chromatinarchitektur bei der Entstehung räumlich-zeitlicher Unterschiede in HEB. Darüber hinaus wird dadurch auch vermittelt, wie der Ausdruck Plastizität in Allopolyploiden während der gesamten Entwicklung genutzt wird.

Über die Auswirkung der Umweltstressoren auf die Expressionsverzerrung hinaus wurde auch über eine Variabilität der Expressionsverzerrung in den verschiedenen Geweben bei mehreren alloplyploiden Arten berichtet, beispielsweise bei Raps56, Baumwolle57, Kaffee58 und Weißklee59. Frühere Arbeiten an hexaploidem Weizen haben auch gezeigt, dass Triaden mit unterschiedlichen Expressions-Bias-Mustern in verschiedenen Geweben gewebespezifischer sind36. In dieser Studie unter Verwendung von SHW-Transkriptomen verdeutlicht der moderate Zusammenhang zwischen Homöologen-Expressionsverzerrungen und Gewebespezifität von Homöologen in den Triaden die mögliche Rolle der Expressionsspezifität von Homöologen bei der Richtungsbestimmung der Expressionsverzerrungen. Daher bestimmen das Gewebe, das Entwicklungsstadium, Umwelteinflüsse und der elterliche Genotyp alle die Voreingenommenheitsmuster der Triaden, indem sie die zusätzliche Plastizität in den hexaploiden Weizengenomen im Vergleich zu ihren tetraploiden und diploiden Vorläufern ausnutzen.

Zusätzlich zum Vergleich der Expressionsmuster zwischen Homöoallelen ergab die differenzielle Expressionsanalyse auf der Ebene des gesamten Genoms zwischen den Eltern- und SHW-Linien, die zur Charakterisierung der Expressionsänderungen der Gene zwischen verschiedenen genomischen Hintergründen durchgeführt wurde, die groß angelegte Repression der D-Subgenom-Gene . Das Eindringen chromosomaler Segmente von Arten im sekundären und tertiären Genpool hat zu transkriptomischen Veränderungen sowohl bei Weizen60,61,62,63 als auch bei anderen polyploiden Arten64,65 geführt. Insbesondere zeigte die transkriptomische Analyse von Weizen × Ambylopyrum muticum-Introgressionslinien die unterdrückte Expression von Genen in den introgressierten Segmenten60. In ähnlicher Weise wurde in den Expressionsstudien von Weizen-Gerste-Additionslinien ein höherer Anteil der Gene in der introgressierten Region herunterreguliert61. Das Eindringen fremder Chromatinsegmente in eine Art führt zur Unterdrückung fremder Transkripte durch das Wirtsgenom; Allerdings bleibt unklar, wie das Wirtsgenom das fremde Genom unterscheidet. Kombination des D-Genoms von Ae. Tauschii mit dem AB-Genom in T. turgidum führt zu analogen Reaktionen, was darauf hindeutet, dass das AB-Genom als natives Genom und das D-Genom als eingeführtes Fremdchromatin in SHWs fungiert.

Das Ergebnis eines Polyploidisierungsereignisses auf genomischer und folglich phänotypischer Ebene hängt vom genetischen Hintergrund der am Hybridisierungsereignis beteiligten Linien ab66,67. Die Bewertung mehrerer SHW-Linien, die aus verschiedenen tetraploiden und diploiden Akzessionen stammen, zeigte eine Variabilität in der Reaktion auf eine FHB-Infektion, die auf der Grundlage der FHB-Reaktionen der Eltern nicht vorhersehbar war68. Eine ähnliche Variabilität basierend auf genotypischen Hintergrundeffekten wurde für ertragsbezogene Merkmale von Weizenlinien mit Roggenintrogressionen beobachtet69.

Die Unterschiede im Expressionsniveau aufgrund der Polyploidisierung zur Erzielung eines Dosierungsgleichgewichts, zur Etablierung einer homöollenspezifischen Expression oder zur Darstellung genomischer Hintergrundeffekte sind möglicherweise alle Ausdruck der genetischen und epigenetischen Veränderungen, die bei der Polyploidisierung auftreten. Die Analyse synthetischer Linien und ihrer tetraploiden und diploiden Eltern auf Chromosomenebene mithilfe molekularzytogenetischer Techniken hat strukturelle Unterschiede in Chromatinregionen aufgezeigt70, und auch die Analyse auf Genomsequenzebene hat ähnliche Ergebnisse ergeben71,72. Aus epigenetischer Sicht wurden microRNAs (miRNAs), die Schlüsselakteure der posttranskriptionellen Genregulation, in resynthetisiertem Weizen auf nicht-additive Weise exprimiert41. Die veränderte Expression von miRNAs liegt möglicherweise der Downstream-Verschiebung der Expressionsverzerrung und Repression in den mRNA-Daten zugrunde. Von doppelsträngigen RNA-Molekülen abgeleitete Small Interfering RNAs (siRNAs) waren an der Methylierung von DNA-Sequenzen, insbesondere transponierbaren Elementen, und auch an der Etablierung repressiver Heterochromatinmarkierungen beteiligt73. Vergleich eines neu synthetisierten hexaploiden Weizens und seiner Ae. Tauschii-Eltern zeigten eine erhöhte Akkumulation von siRNAs auf den D-Homöologen im Hexaploiden, im Gegensatz zu den Beobachtungen bei T. turgidum vs. hexaploiden A-Subgenomen41. Die erhöhte Akkumulation von siRNAs könnte die zugrunde liegende Ursache für die Unterdrückung von D-Homöologen in Hexaploiden sein41. Die DNA-Methylierung ist ein epigenetisches Merkmal für die Regulierung der Genexpression und die Genomstabilität durch die Stummschaltung transponierbarer Elemente (TEs). Die Änderungen auf Ploidieebene führen zu einer Modifikation der Methylierungsmuster in CG-, CHG- und CHH-Sequenzkontexten in Weizen, an der auch die TEs beteiligt sind. Da TEs den größten Teil des Weizengenoms einnehmen, moduliert eine solche epigenetische Neuprogrammierung der TE-Fraktion die Expression von Genen in ihrer Umgebung, da TEs Promotor- und Enhancer-Motive enthalten74,75. Unter den zahlreichen Histonmarkierungen im Genom wurde festgestellt, dass ein Anstieg der repressiven Histon-3-Lysin-27-Dimethylierungen (H3K27me2) positiv mit dem Anstieg der Ploidie in Weizen korreliert76. Darüber hinaus liegen die H3K27me3-Markierungen der subgenomspezifischen Aktivität regulatorischer Elemente zugrunde77, und die Einführung des D-Subgenoms löst deutliche Histonmodifikationen und daraus resultierende regulatorische Wechselwirkungen zwischen Subgenomen29 aus. Die Zugänglichkeit des Chromatins, die durch die Assoziation zwischen Transkriptionsfaktoren und Nukleosomen gesteuert wird, ist im D-Subgenom von Hexaploiden im Vergleich zum Ae geringer. Tauschii-Hintergrund, was ebenfalls zu einer erheblichen Verringerung der Genexpression führt78. Zusätzlich zu diesen genetischen und epigenetischen Veränderungen erfordert die Veränderung der Chromatinarchitektur bei Polyploidisierung auch eine Untersuchung bei hexaploidem Weizen. Beispielsweise wurden Veränderungen in den topologisch assoziierten Domänen (TAD) und der A/B-Kompartimentierung bei anderen polyploiden Nutzpflanzenarten wie Wassermelone79 und Baumwolle80 berichtet.

Nach der Gentranskription werden Vorläufer-mRNAs mithilfe der Spleißmaschinerie modifiziert, um reife RNAs zu produzieren. Während dieses Prozesses kann die Spleißmaschinerie durch alternatives Spleißen (AS) unterschiedliche Kombinationen von Introns und Exons beibehalten. Dieser AS-Mechanismus kann die Transkriptions- und Translationsprodukte eines Gens diversifizieren und dadurch seine Funktion im Entwicklungsrahmen von Raum (verschiedene Gewebe) und Zeit (vegetative vs. reproduktive Stadien) verändern81. Es gibt gewebespezifische Isoformen sowie abiotische82 und biotische83 stressinduzierte AS-Ereignisse. Allerdings wurden die Auswirkungen der Polyploidisierung und des daraus resultierenden genomischen Schocks auf AS erst kürzlich untersucht. In einer Studie über hexaploiden Weizen und seine tetraploiden und diploiden Eltern und Verwandten fanden Yu et al.84 außerdem heraus, dass das zurückgehaltene Intron der am häufigsten beobachtete AS-Mechanismus war. Die Dominanz der Intronretention wurde bei allen Pflanzenarten beobachtet, darunter Arabidopsis85, Reis, Sorghum und Mais86 sowie Baumwolle87. Der Einfluss der Polyploidisierung auf unterschiedliche Spleißereignisse wurde bei allopolyploiden Rapssamen beobachtet, zusammen mit homöologenspezifischen Unterschieden bei AS88. Bei der Charakterisierung von AS im Transkriptom, das aus Embryogenesegeweben in Weizen und seinen Vorläufern stammt, überwogen alternative 3'-Spleißereignisse. Der Unterschied wurde jedoch auf die AS-Ereignisspezifität des Analysetools und den Prozentsatz der verwendeten Spleißschwellen zurückgeführt89.

Zusammenfassend ergab die Analyse der globalen Transkriptomdynamik in SHWs im Vergleich zu ihren tetraploiden und diploiden Eltern eine Expressionsverzerrung unter Homöologen, die zu einer groß angelegten Unterdrückung des D-Subgenoms in den SHWs führte, wie aus mehr als 18.000 Triaden und der Expression aus zehn Geweben abgeleitet wurde. Qualitative Veränderungen, die bei Transkripten in Form neuer Spleißvarianten bei der Polyploidisierung beobachtet wurden, wirkten sich ebenfalls stark auf die Homöologen des D-Genoms aus. Diese quantitativen (Transkripthäufigkeit) und qualitativen (Spleißvarianten) Expressionsänderungen scheinen von der genomischen Zusammensetzung der Eltern und dem Entwicklungsstadium (Gewebe) der Weizenlinien abhängig zu sein. Um die genetische Vielfalt der D-Genom-Vorläufer (Ae. tauschii) und anderer wildlebender Verwandter für die Weizenverbesserung durch interspezifische Hybridisierung zu nutzen, muss die Möglichkeit einer veränderten Expression in den Nachkommen berücksichtigt werden, um den gewünschten Phänotyp im polyploiden Hintergrund wiederherzustellen.

Vier SHW-Linien (C44, C45, C65 und C66) und ihre zwei tetraploiden (PI377655–C16, Langdon–C19) und zwei diploiden (AS2386–C26, AS2399–C30) Eltern, also insgesamt acht Genotypen, wurden in der Studie verwendet Studie (Ergänzungstabelle 1). Die folgenden zehn Gewebeproben (ergänzende Abbildung 1) wurden aus den oben genannten acht Linien entnommen: (1) Kopf im Stiefelstadium, (2) Spross am Kopf gesammelt, (3) Deckspelze und Vorspelze am Kopf, (4) Hüllspelze von erstes und zweites Blümchen einer Ähre, (5) Stempel – wenn die Staubbeutel grün und unreif sind, (6) Stempel – wenn die Staubbeutel gelb sind und kurz vor der Dehiszenz stehen, (7) Stempel – einen Tag nach der Blüte, (8) gelber Staubbeutel kurz vor der Dehiszenz, (9) Hypokotyl und (10) Wurzel, wobei die beiden letztgenannten Gewebe von jungen Sämlingen gesammelt wurden, die auf Whatman-Filterpapier gezüchtet wurden. In der Studie wurden drei biologische Replikate pro Gewebe aller acht Genotypen verwendet (zehn Gewebe × acht Genotypen × drei Replikate = 240 Proben).

Das RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen Inc., Germantown, MD, USA) wurde für alle Gewebe verwendet, mit Ausnahme des reifen Staubbeutels und des Stempels, wenn die Staubbeutel grün und unreif sind und die mit dem miRNeasy Mini Kit (Qiagen Inc.) isoliert wurden. Die extrahierten RNAs wurden zunächst mit dem Implen Nanophotometer (Implen Inc, Westlake Village, CA, USA) quantifiziert und die Qualität und Konzentration mit dem Agilent RNA 6000 Nano Assay (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) bewertet. Der Aufbau von cDNA-Bibliotheken und die Sequenzierung wurden am Centre d'expertise et de services Génome Québec (Montreal, QC, Kanada) durchgeführt. Kurz gesagt, die mRNA-Anreicherung wurde mit dem NEBNext Poly(A) Magnetic Isolation Module (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA) durchgeführt, gefolgt von der cDNA-Synthese und Bibliotheksvorbereitung mit den Modulen NEBNext RNA First Strand Synthesis und NEBNext Ultra Directional RNA Second Strand Synthesis und das NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit (New England BioLabs). Die Bibliotheken wurden mit dem PicoGreen dsDNA-Assay-Kit quantifiziert und die Qualität mit LabChip GX (PerkinElmer, MA, USA) analysiert. Die normalisierten Bibliotheken wurden auf einem Illumina cBot geclustert und 100-bp-Paired-End-Reads wurden auf einer HiSeq 4000-Plattform (Illumina Inc., CA, USA) für die reifen Staubbeutel und die Stempel generiert, die gesammelt wurden, als die Staubbeutel noch unreif waren, d. h , vor der Bestäubung. Die anderen acht Gewebe wurden als 150-bp-Paired-End-Reads auf der NovaSeq 6000-Plattform (Illumina Inc.) sequenziert.

Die Sequenzierungsablesungen wurden mit Trimmomatic90 vorverarbeitet und nach der Genomindizierung mit der kürzlich aktualisierten Version der Pseudomoleküle des Brotweizengenoms (RefSeq v2.1; Annotation v2.1)33 unter Verwendung von Spliced ​​Transcripts Alignment to a Reference (STAR)91 abgeglichen. wobei die maximale Intronlänge auf 10.000 bp eingestellt ist, die maximale Anzahl zulässiger Fehlpaarungen auf sechs eingestellt ist und die anderen Parameter auf ihren Standardeinstellungen belassen werden.

Im Brotweizengenom liegen fast 35 % der Gene als Triaden vor, mit einer homöologen Kopie in jedem der Subgenome (1:1:1 in A:B:D)34. Mit der Refseq v1.0-Annotation wurden insgesamt 18.474 Triaden identifiziert. Nach Berücksichtigung der in der Refseq v2.1-Annotation vorgenommenen Überarbeitungen wurde jedoch für diese Studie vergleichender Transkriptome ein Satz von 18.357 Triaden verwendet, die aus mit hoher Zuverlässigkeit annotierten Genmodellen 33, 34 bestanden. Aus den Genzähldaten wurde eine Expressionsmatrix erstellt, und die RPKM-Werte (Reads per Kilobase per Million Mapped Reads) wurden aus den Rohzähldaten mithilfe der rpkm-Funktion in EdgeR92 geschätzt. Der Homoeologue Expression Bias (HEB), der die Anzahl der Fold Bias und deren Richtung darstellt, wurde mithilfe der folgenden Formel geschätzt35.

Dabei stellen RPKMAB und RPKMD die Expressionswerte aus den AB- bzw. D-Subgenomen dar. Für die RPKM-Expressionswerte aus dem AB-Subgenom wurde der Durchschnitt zwischen den Expressionsniveaus der A- und B-Homöologen eines Triaden-Gensatzes unter Berücksichtigung der ausgewogenen Expressionsniveaus der A-, B- und D-Homöologen und des Unterschieds in der Genlänge verwendet wird durch die Normalisierung berücksichtigt.

Darüber hinaus wurde der von Smith et al.35 auf MATLAB entwickelte und erstmals von Edger et al.93 verwendete Likelihood-Ratio-Test angewendet, um die Triaden zu identifizieren, die eine signifikante Tendenz zum tetraploiden (AABB) oder diploiden (DD) Genom aufweisen. Likelihood-Ratio-Tests wurden unter Verwendung der Expressionsdaten der SHW-Linien sowie der Daten ihrer entsprechenden tetraploiden und diploiden Eltern durchgeführt, wodurch ein In-silico-SHW ohne Interaktionen zwischen Subgenomen erstellt wurde, um die Verschiebung der Expressionsverzerrung bei der Polyploidisierung zu bestimmen. Die vorgelagerten Eingabevorbereitungs- und nachgelagerten Zusammenfassungsschritte wurden mit benutzerdefinierten Skripten in Bash und R durchgeführt. Um die Bias-Muster von gewebespezifischen und breit exprimierten Genen zu untersuchen, wurde die Tau-Methode94 für alle Genotypen mit einem Cut-off von 0,8 verwendet . Die Stärke des Zusammenhangs zwischen der Gewebespezifität der Homöologen und der Expressionsverzerrung der Triaden wurde mithilfe der Cramer-V-Statistik geschätzt und die Signifikanz des Zusammenhangs mithilfe des Chi-Quadrat-Unabhängigkeitstests bestimmt. Die genontologische Analyse der Homöologen in Triaden aus Wurzel- und reifen Antherengeweben, wobei A-, B- und D-Homöologen über alle vier SHW-Linien hinweg die gleiche Gewebespezifität zeigten, wurde mit dem Triticeae-Gene Tribe Toolkit95 durchgeführt. Die R-Skripte, die zur Vorbereitung der Eingabedateien für LRT- und Gewebespezifitätsanalysen verwendet werden, sind unter https://github.com/akshaya-v/SHW-Expression-bias verfügbar.

Um die HEB in domestizierten Weizenlinien zu entschlüsseln, wurden die RNA-seq-Daten von Ramírez-Gonzalez et al.36 für die Landrasse Chinese Spring und die Sorte Azhurnaya für die folgenden Gewebe heruntergeladen: Chines Spring: Blatt (nach 14 Tagen), Wurzel ( nach 14 Tagen), Eierstock (frühe Anthese), Eierstock (späte Anthese) und Ähre (beim Booten); Azhurnaya: Narbe und Eierstock (Anthese), Hüllspelzen (Milchkornstadium), Staubbeutel (Anthese), Wurzel (Sämling), Ähre (30 % Ähre heraus). Die nachgelagerte Leseverarbeitung, Ausrichtung und HEB-Analyse wurde wie oben für die SHWs beschrieben durchgeführt.

Die gelesenen Zähldaten aus den zehn Geweben wurden in zwei Pools gruppiert: vegetativ (Spross, Wurzel, Hypokotyl, Hüllspelze und Vorspelze + Deckspelze) und reproduktiv (Kopf, Stempel – wenn die Staubbeutel grün sind, Stempel – wenn die Staubbeutel gelb sind, Stempel – einer Tag nach der Anthese und gelbe Anthere kurz vor der Dehiszenz). Die Logik bestand darin, die Gewebe, die nur aus vegetativen Zellen bestehen, in einem Pool zu gruppieren und die Gewebe, die sowohl aus vegetativen als auch aus reproduktiven Zellen bestehen, in einem anderen Pool. Die differenzielle Expressionsanalyse in den beiden Pools wurde mit dem Statistikpaket „edgeR“92 durchgeführt, und eine Falscherkennungsrate (FDR) von <0,05 und ein Log-Fold-Change-Grenzwert (LogFC) von ±2,00 wurden als Schwellenwerte für die Schlussfolgerung auf differenziell exprimierte Gene angewendet.

Die alternative Spleißanalyse wurde mit rMATS96 durchgeführt. Es wurden die mit STAR generierten BAM-Dateien verwendet. Die Option „Clipping zulassen“ wurde aktiviert, um Ausrichtungen mit Soft-Clipping zu akzeptieren. Die Erkennung neuartiger Spleißstellen, die nicht in den Annotationsdateien vorhanden sind, wurde mithilfe der NovelSS-Option ermöglicht. Die alternative Spleißanalyse wurde für alle acht möglichen Vergleiche zwischen SHW und diploiden/tetraploiden Eltern in den zehn Geweben durchgeführt. Die Sashimi-Plots wurden mit rmats2sashimiplot97 erstellt. Zum Vergleich wurden die Anzahl und Arten der in Eltern- oder SHW-Linien nachgewiesenen differentiell gespleißten Isoformen zusammengefasst. Die alternativen Spleißtypen waren alternative 3'-Spleißstelle, alternative 5'-Spleißstelle, sich gegenseitig ausschließende Exons, beibehaltenes Intron und übersprungenes Exon.

Es wurden drei biologische Replikate pro Gewebe und Genotyp verwendet. Es gab zehn Gewebe und acht Genotypen, also insgesamt 240 Gewebeproben. Der Likelihood-Ratio-Test zum Nachweis signifikanter HEB wurde mit der Nullhypothese durchgeführt, dass die Homöologen gleiche Expressionsniveaus in den AB- und D-Subgenomen aufweisen, und der alternativen Hypothese, dass die Homöologen unterschiedliche Expressionsniveaus zwischen den Subgenomen aufweisen, wie in Smith et al.35 beschrieben . Die Differenzialausdrucksanalyse wurde mit EdgeR92 v3.38.4 mit FDR < 0,05 und logFC-Grenzwert ±2,00 durchgeführt. Die alternative Spleißanalyse wurde mit rMATS96 unter Verwendung des Standard-Spleißdifferenz-Grenzwerts von 0,01 % durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die rohen RNA-seq-Daten wurden im Short Read Archive (SRA) des NCBI unter dem Bioprojekt PRJNA905376 hinterlegt. Die Basisdaten für die HEB-Zahlen, alternative Spleißzahlen und Ergebnisse der Gewebespezifitätsanalysen sind in Figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.6443621) (Ref. 98) verfügbar.

Der Quellcode der R-Skripte, die zur Vorbereitung von Eingabedateien und allen anderen Analysen verwendet werden, wird im Abschnitt „Methoden“ bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Die Arbeit wurde im Rahmen des Projekts 4D Wheat: Diversity, Discovery, Design and Delivery unterstützt – einer Partnerschaft von Genome Canada, Agriculture and Agri-Food Canada und Interessenvertretern der Weizenindustrie mit administrativer Unterstützung von Genome Prairie (Projekt J-002319). Die Arbeit wurde auch von der Canadian Agricultural Partnership (Projekt J-001961) unterstützt. Die Autoren danken außerdem Dr. Ronald D. Smith, College of William & Mary, USA, für die Aufklärung zu LRT MATLAB-Codes und Dr. Sridhar Ravichandran für seine Unterstützung bei der RNA-Extraktion und ersten Datenübertragungen.

Agriculture and Agri-Food Canada, Ottawa Research and Development Centre, Ottawa, ON, Kanada

Akshaya Vasudevan, Madeleine Lévesque-Lemay, Tara Edwards und Sylvie Cloutier

Abteilung für Biologie, Universität Ottawa, Ottawa, ON, Kanada

Akshaya Vasudevan und Sylvie Cloutier

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SC hat die Studie entworfen. SC, ML-L. und TE führte die Experimente durch und sammelte Daten. AV und SC finalisierten die Datenanalysemethoden, führten die Datenanalyse durch, interpretierten die Ergebnisse und visualisierten sie. AV und SC haben den Artikel geschrieben. Alle Autoren haben das Papier gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Sylvie Cloutier.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Arunkumar Ramesh, Ahmad Alqudah und dem anderen, anonymen Gutachter für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Joao Valente.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Vasudevan, A., Lévesque-Lemay, M., Edwards, T. et al. Die globale Transkriptomanalyse der Allopolyploidisierung zeigt eine groß angelegte Unterdrückung des D-Subgenoms in synthetischem hexaploiden Weizen. Commun Biol 6, 426 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04781-7

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Eingegangen: 17. Juni 2022

Angenommen: 30. März 2023

Veröffentlicht: 17. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04781-7

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