Struktur der menschlichen NK-Zelle NKR

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 5022 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Signalübertragung durch den menschlichen C-Typ-Lectin-ähnlichen Rezeptor, den natürlichen Killerzellen-Hemmrezeptor (NK) NKR-P1, spielt bei vielen immunbedingten Erkrankungen und Krebs eine entscheidende Rolle. C-Typ-Lectin-ähnliche Rezeptoren haben schwache Affinitäten zu ihren Liganden; Daher ist es notwendig, ein umfassendes Modell der NKR-P1-LLT1-Wechselwirkungen zu erstellen, das den natürlichen Zustand des Rezeptors auf der Zelloberfläche berücksichtigt, um seine Funktionen zu verstehen. Hier berichten wir über die Kristallstrukturen der NKR-P1- und NKR-P1:LLT1-Komplexe, was den Beweis liefert, dass NKR-P1 Homodimere in einer unerwarteten Anordnung bildet, um die LLT1-Bindung auf zwei Arten zu ermöglichen und zwei LLT1-Moleküle zu überbrücken. Diese Interaktionscluster lassen auf eine inhibitorische Immunsynapse schließen. Durch die Beobachtung der Bildung dieser Cluster in Lösung mittels SEC-SAXS-Analyse, durch hochauflösende dSTORM-Mikroskopie auf der Zelloberfläche und durch die Verfolgung ihrer Rolle bei der Rezeptorsignalisierung mit frisch isolierten NK-Zellen zeigen wir, dass nur die Ligation beider LLT1-Bindungen erfolgt Schnittstellen führen zu einer wirksamen NKR-P1-inhibitorischen Signalübertragung. Zusammenfassend stützen unsere Ergebnisse insgesamt ein Modell der NKR-P1:LLT1-Clusterbildung, das es den interagierenden Proteinen ermöglicht, die schwache Ligand-Rezeptor-Affinität zu überwinden und bei Zellkontakt in der Immunsynapse eine Signaltransduktion auszulösen.

Natürliche Killerzellen (NK) sind Lymphozyten des angeborenen Immunsystems, die mit einer Vielzahl aktivierender und hemmender Oberflächenrezeptoren ausgestattet sind und es ihnen ermöglichen, bösartige, infizierte oder andere transformierte Zellen durch „fehlende“ und „induzierte Selbst“-Mechanismen empfindlich zu erkennen und abzutöten durch antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC)1. Darüber hinaus tragen NK-Zellen auch zur Initiierung und Entwicklung der adaptiven Immunantwort bei, indem sie mehrere Klassen von Zytokinen sezernieren, insbesondere proinflammatorisches IFN-γ1. Interessanterweise zeigen neuere Erkenntnisse, dass NK-Zellen sogar eine Form des immunologischen Gedächtnisses aufrechterhalten können1,2, was die Hauptrolle der NK-Zellen bei der Immunität, insbesondere über ihre Rezeptoren, weiter unterstreicht.

NK-Rezeptoren umfassen zwei strukturell unterschiedliche Klassen: die Familien der Immunglobulin-ähnlichen Rezeptoren und der C-Typ-Lectin-ähnlichen Rezeptoren (CTLR)3,4. CTLRs werden im natürlichen Killergenkomplex (NKC, menschliches Chromosom 12) kodiert, und im Gegensatz zu C-Typ-Lektinen binden CTLRs weder Calciumionen noch binden sie an Kohlenhydratliganden5,6. Stattdessen ist bekannt, dass CTLRs mit Proteinliganden interagieren. Beispielsweise erkennen Rezeptoren wie Ly49, CD94/NKG2 oder NKG2D MHC-Klasse-I-ähnliche Moleküle3, wohingegen Rezeptoren der NKR-P1-Unterfamilie strukturell stark verwandte Clr/Ocil-CTLRs erkennen. Diese werden von CLEC2-Genen3,5 kodiert, die genetisch eng mit den NKR-P1-kodierenden KLR-Genen verknüpft sind. Dieses einzigartige CTLR:CTLR-Interaktionssystem ist sowohl an der Nicht-MHC-Erkennung fehlender Selbst als auch an der Erkennung induzierter Selbst beteiligt3,4,5. Bei Mäusen und Ratten wurden mehrere hemmende und aktivierende NKR-P1-Rezeptoren beschrieben; Allerdings ist der menschliche Rezeptor NKR-P1 (CD161, KLRB1-Gen) seit 1994 das einzige bislang beschriebene menschliche Ortholog7. Dennoch wurden aufgrund der strukturellen und funktionellen Homologie zu NKR-P1 die humanen aktivierenden CTLR:Ligand-Paare NKp65:KACL (KLRF2:CLEC2A)8 und NKp80:AICL (KLRF1:CLEC2B)9 als aktivierende Gegenstücke von humanem NKR-P1 vorgeschlagen. P14,10.

Humanes NKR-P1 (CD161) wurde erstmals als Marker für NK-Zellen7 beschrieben, in denen NKR-P1 als inhibitorischer Rezeptor7,11,12 fungiert, der durch IL-1213 hochreguliert wird. Allerdings wird NKR-P1 auch von natürlichen Killer-T-Zellen (NKT)14, mukosal-assoziierten invarianten T-Zellen (MAIT)15 und anderen Untergruppen von T-Lymphozyten16 exprimiert, wobei NKR-P1 als co-stimulierender Rezeptor fungiert und die IFN- γ-Sekretion11,17. Es überrascht nicht, dass NKR-P1 sogar in unreifen CD16-CD56-NK-Zellen18 und in Vorläufern von Th17- und MAIT-Zellen im Nabelschnurblut nachgewiesen wird19. Kürzlich wurde NKR-P1 in Gliom-infiltrierenden T-Zellen identifiziert, das eine hemmende, immunsuppressive Rolle bei der T-Zell-vermittelten Abtötung von Gliomzellen spielt20. Darüber hinaus fördert NKR-P1 die transendotheliale Migration in immunologisch privilegierte Nischen bei Interaktion mit seinem endogenen Liganden, dem Lektin-ähnlichen Transkript 1 (LLT1)19,21,22.

LLT1 (Gen CLEC2D) wird hauptsächlich auf aktivierten Monozyten und B-Zellen exprimiert23. In diesen Zellen trägt LLT1 zur Aufrechterhaltung der Selbsttoleranz der NK-Zellen bei10,23. Allerdings kann IL-2 seine Expression auf NK- und T-Zellen induzieren24. Darüber hinaus ist LLT1 bei Glioblastomen25, Prostatakrebs und dreifach negativem Brustkrebs26,27 sowie B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphomzellen28 hochreguliert, bei denen LLT1 zur Immunumgehung beiträgt, indem es die Zytotoxizität von NK-Zellen dämpft. Interessanterweise wurde eine erhöhte Anzahl von CD161+ Th17-Zellen in Gliomtumoren nachgewiesen29. Gleichzeitig sind die Funktionen von NKR-P1-Rezeptoren auf IL-17-produzierenden regulatorischen T-Zellen30, auf Untergruppen von Tc17-Zellen31 und auf allen Th17-Zellen19 besonders relevant, da diese Zellen an mehreren Autoimmunerkrankungen beteiligt sind (Morbus Crohn32, Multiple Sklerose33, rheumatoide Arthritis34 und Psoriasis35). Daher ist die Analyse von NKR-P1-Rezeptoren und Liganden wie LLT1 unerlässlich, um einen tieferen Einblick in die Struktur-Funktions-Beziehungen zu gewinnen, die sowohl physiologischen als auch pathogenen Prozessen im Immunsystem zugrunde liegen.

Menschliches NKR-P1 und LLT1 sind Transmembran-Glykoproteine ​​vom Typ II mit ähnlicher Proteintopologie4: einem N-terminalen zytoplasmatischen Signalschwanz, einer Transmembranhelix, einer flexiblen Stielregion und einer C-terminalen C-Typ-Lektin-ähnlichen Domäne (CTLD)3. 7,36. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass sowohl NKR-P1 als auch LLT1 Disulfidhomodimere7,36 bilden, die wahrscheinlich in ihren Stielregionen verknüpft sind. Allerdings ist die Struktur des NKp65:KACL-Komplexes37 der einzige unter allen Komplexen der humanen C-Typ-Lektin-ähnlichen (CTL) Rezeptor:Ligand-Unterfamilie, der bisher aufgeklärt wurde. Eine nachfolgende Studie zeigte außerdem, dass die Wechselwirkung zwischen NKp65 und KACL proteinbasiert und unabhängig von der Glykosylierung ist38. Basierend auf diesen Daten wurde anschließend ein Modell des NKR-P1:LLT1-Komplexes vorgeschlagen und wichtige Interaktionsreste wurden durch Oberflächenplasmonresonanzanalyse (SPR) von NKR-P1- und LLT1-Mutanten identifiziert, was die schnelle Kinetik dieser Interaktion hervorhob39,40 . Darüber hinaus wurde kürzlich über die Strukturen der verwandten Maus-NKR-P1B-Ektodomäne berichtet, die mit dem murinen Cytomegalovirus (MCMV)-Immunevasin-Protein m12 oder mit seinem verwandten Liganden Clrb komplexiert ist41,42. Zuvor haben wir über die erste Struktur von LLT143 berichtet, die unabhängig von der Glykosylierung44 ein nichtkovalentes Dimer bildet und dem für CD6945,46 und Clrg47 beobachteten konservierten Dimerisierungsmodus der CLEC2-kodierten Liganden folgt. Ungeachtet dessen ist noch kein umfassendes Modell der Dimer:Dimer-Wechselwirkung der CTLR:Ligand-Komplexe verfügbar, das dem natürlichen Zustand dieser Proteine ​​entspricht, wenn sie auf der Zelloberfläche exprimiert werden.

Hier untersuchen wir die Struktur von menschlichem NKR-P1 und untersuchen die Auswirkungen der NKR-P1-Dimerisierung auf die LLT1-Bindung. Wir präsentieren die Kristallstruktur von NKR-P1 im Komplex mit LLT1, erläutern die bisherigen Beobachtungen der Wechselwirkung in Lösung und zeigen einen neuartigen Aufbau dieses Komplexes unter Verwendung zweier unterschiedlicher, nicht symmetrischer Bindungsstellen auf LLT1. Unsere Ergebnisse erklären, wie der menschliche NKR-P1-Rezeptor seine schwache Affinität für LLT1 durch durch Ligandenbindung induzierte Vernetzung und Clusterbildung überwindet, und klären die Art der Signaltransduktion dieses Rezeptors innerhalb der NK-Zell-Immunsynapse auf, wodurch ein gutes Modell dafür bereitgestellt wird zukünftige Beschreibung verwandter homologer Komplexe mit niedriger Affinität.

Zwei Kristallstrukturen der menschlichen NKR-P1-Ektodomäne wurden gelöst: die Struktur von glykosyliertem NKR-P1 mit einheitlichen Asn-GlcNAc2Man5-N-Glykanen (NKR-P1_glyco) und von deglykosyliertem NKR-P1 mit nach dem ersten GlcNAc-Rest abgespaltenen N-Glykanen (NKR-P1_deglyco); Statistische Daten zu allen Strukturen sind in Tabelle 1 aufgeführt. NKR-P1 folgt in beiden Kristallstrukturen der allgemeinen Faltungscharakteristik einer CTL-Domäne – zwei α-Helices (α1 und α2) und zwei antiparallele β-Faltblätter mit dem konservierten hydrophoben WIGL-Motiv darin der Domänenkern (Abb. 1 und 2a). Die beiden β-Faltblätter werden durch die β-Stränge β0, β1, β1' und β5 bzw. β2, β2′, β3 und β4 gebildet (Zuordnung nach Zelensky und Gready5, die auch zur Beschreibung anderer verwandter CTL-Strukturen verwendet wird37,40 ). Darüber hinaus stabilisieren drei intramolekulare Disulfidbindungen die Domäne: Cys94-Cys105, Cys122-Cys210 und Cys189-Cys202.

Sekundärstrukturelemente und Schleifenregionen (L) sind für NKR-P1 und LLT1 über den Ausrichtungen angegeben. Die gepaarten Zahlen unten geben die Disulfidpaare in den NKR-P1- und LLT1-Strukturen an; Sternchen markieren die His176Cys-Mutation in LLT1 und den Ile168-Rest in NKR-P1. Die vorhergesagten N-Glykosylierungsstellen von NKR-P1 und LLT1 sind mit orangefarbenen Dreiecken gekennzeichnet. Die konservierten WIGL-Motive sind schwarz unterlegt. Blaue Linien über der Sequenz zeigen die Regionen an, die die nichtkovalenten Dimere von NKR-P1 oder LLT1 bilden. Konservierte Rückstände sind rot markiert; Fettgedruckte Buchstaben bezeichnen streng konservierte Reste. a Sequenzabgleich von CTLDs menschlicher NKR-P1-verwandter NK-Zellrezeptoren, d. h. menschlicher NKR-P1, NKp65 und NKp80. NKR-P1-Reste, die LLT1 im NKR-P1:LLT1-Komplex im primären Bindungsmodus kontaktieren, und NKp65-Reste, die KACL im NKp65:KACL-Komplex kontaktieren, sind grün hervorgehoben. Lila Dreiecke zeigen NKR-P1-Reste an, die LLT1 im NKR-P1:LLT1-Komplex im sekundären Bindungsmodus einbinden. b Sequenz-Alignment von CTLDs von LLT1-verwandten menschlichen CLEC2-Liganden, d. h. LLT1, KACL und AICL. LLT1-Reste, die NKR-P1 im NKR-P1:LLT1-Komplex im primären Bindungsmodus kontaktieren, und KACL-Reste, die NKp65 im NKp65:KACL-Komplex kontaktieren, sind grün hervorgehoben. Lila Dreiecke zeigen LLT1-Reste an, die NKR-P1 im NKR-P1:LLT1-Komplex im sekundären Bindungsmodus binden. Das Alignment wurde in Clustal Omega83 durchgeführt und die Grafiken wurden in ESPript 3.084 erstellt.

ein Banddiagramm des NKR-P1 CTLD. Sekundärstrukturelemente sind in verschiedenen Farben gekennzeichnet: Helix α1 ist rot, Helix α2 ist gelb und β-Stränge und Schleifen sind cyan. b Vergleich zwischen NKR-P1-Dimeren, die aus den glykosylierten (cyan), deglykosylierten freien (grün) und LLT1-gebundenen (blau) Formen von NKR-P1 gebildet werden. c Vergleich zwischen Helices α1- und α2-zentrierter Dimerisierung von murinem Dectin-1 (https://doi.org/10.2210/pdb2CL8/pdb, magenta) und menschlichem LLT1 (https://doi.org/10.2210/pdb4QKI/pdb). , grün) bzw.; Die Helices α1 und α2 sind in Rot und Gelb dargestellt. Auf der rechten Seite sind strukturelle Ausrichtungen von Dectin-1- und NKR-P1-Homodimeren sowie LLT1- und NKR-P1-Homodimeren dargestellt, die durch Ausrichtung nur eines Monomers von jedem Dimer hergestellt wurden. Obwohl die CTLD-Faltung in jedem Paar der ausgerichteten Monomere erhalten bleibt, zeigen die Helix-α1- und Helix-α2-zentrierten Dimere eine umgekehrte Anordnung.

Die asymmetrische Einheit von NKR-P1_glyco enthält zwei Monomere, während die asymmetrische Einheit von NKR-P1_deglyco acht NKR-P1-Monomere enthält. Alle diese Monomere sind in sehr ähnlichen Homodimeren angeordnet, mit paarweisem RMSD an Cα-Atomen von bis zu 0,5 Å (Abb. 2b). Allerdings haben diese Homodimere eine unerwartete Konfiguration: Sie folgen nicht dem üblichen Dimerisierungsmodus, der für CTLDs der CLEC2-Liganden wie CD69 oder LLT1 mit Helix α2 an der Dimerisierungsschnittstelle beobachtet wird. Stattdessen wird die Dimerisierungsschnittstelle von NKR-P1 durch die Helix α1 gebildet, wie im murinen C-Typ-Lektin-ähnlichen Mustererkennungsrezeptor Dectin-1 (https://doi.org/10.2210/pdb2CL8/pdb)48, mit dem menschliches NKR-P1 weist nur 32 % der Sequenzidentität des CTLD auf (Abb. 2c). Der RMSD der Cα-Atome zwischen NKR-P1- und Dectin-1-Dimeren beträgt 3,7 Å im überlappenden Bereich (entspricht 196 der insgesamt 250 Reste des NKR-P1-Dimers). Die strukturell unterschiedliche Region umfasst hauptsächlich Helices α2, deren Positionen sich zwischen NKR-P1 und Dectin-1 um bis zu 7 Å unterscheiden. Wir beobachteten auch eine sehr ähnliche Anordnung mit Helix-α1-zentrierter Dimerisierungsschnittstelle in der Struktur eines kovalenten Disulfiddimers der NKR-P1B-Rezeptor-Ektodomäne der Ratte (https://doi.org/10.2210/pdb5J2S/pdb)49 mit 1,4 Å RMSD von die Cα-Atome zwischen diesen beiden Dimeren (Ergänzende Abbildung 1a). Im Gegenteil, das nicht-klassische Dimer von Maus-NKR-P1B (https://doi.org/10.2210/pdb6E7D/pdb)42 weist eine völlig andere Gesamtanordnung auf (ergänzende Abbildung 2a).

Die Dimerisierungsschnittstelle des NKR-P1-Homodimers besteht aus sechs Protein-Protein- und mehreren wasservermittelten Wasserstoffbrückenbindungen (Ergänzungstabelle 1), einer Peptidbindungswechselwirkung über delokalisierte Elektronen (Lys126-Glu127) und einem kleinen hydrophoben Kern bestehend aus Leu119 und Ala120 und Ile168 aus beiden Ketten (Abb. 3). Die Kontaktfläche beträgt ca. 500 Å2. Im Vergleich zum Helix-α2-zentrierten LLT1-Dimer (7–12 Wasserstoffbrückenbindungen, stärkerer hydrophober Kern, 500–800 Å2 Kontaktoberfläche)43 bildet sich das Helix-α1-zentrierte NKR-P1-Dimer über eine kleinere Kontaktoberfläche mit weniger Kontaktresten .

a Dimerization interface of human NKR-P1. Subunits of human NKR-P1 are shown as Cα-trace (blue and cyan), and the dimer contact residues are shown as sticks with carbon atoms colored in light blue (blue subunit) and orange (cyan subunit); for clarity, only the residues of the blue subunit are labeled. The first GlcNAc unit N-linked to Asn116 and the carbohydrate chain N-linked to Asn169, observable in the NKR-P1_glyco structure, are shown with carbon atoms colored yellow and green, respectively. b Top view of the dimerization interface. The NKR-P1 subunits surfaces are colored blue and cyan. The GlcNAc units bound to Asn116 are shown as sticks with carbon atoms in yellow. Contact residues between the GlcNAc bound to chain A, and the chain B, are shown in yellow, whereas contact residues between the GlcNAc bound to chain B, and the chain A, are shown in purple. Hydrogen bonds are shown as green-dashed lines with a detailed view on the right-hand side. c Mixed glycosylation states at the dimer interface in the NKR-P1_deglyco structure. The GlcNAc unit N-linked to Asn157 of chain A is modeled with an occupancy of 0.5, while the second GlcNAc unit present at Asn116 of chain B is not modeled. Contours of 2mFo-DFc (2.8σ, cyan) and mFo-DFc (1σ, green) electron density maps are shown. d Small hydrophobic core in the central part of the NKR-P1 dimerization interface (subunits colored as in (a)). The central residues are shown as spheres with carbon atoms in yellow. The carbon atoms of Ile168 residues (whose mutation decreases the ability of NKR-P1 to bind LLT1)C polymorphism in the human KLRB1 gene alters ligand binding and inhibitory potential of CD161 molecules. PLoS One 10, e0135682 (2015)." href="/articles/s41467-022-32577-6#ref-CR51" id="ref-link-section-d57927382e2666">51 werden in Orange dargestellt.

Die NKR-P1-Ektodomäne enthält drei potenzielle N-Glykosylierungsstellen an den Resten Asn116, Asn157 und Asn169 (Abb. 1a). Die Glykosylierung bei Asn169 ist in den Elektronendichtekarten der NKR-P1_glyco- und _deglyco-Strukturen sichtbar. In NKR-P1_glyco ist die vollständige GlcNAc2Man5-Kohlenhydratkette in Kette A lokalisiert, wohingegen eine teilweise GlcNAc2Man3-Kette in Kette B lokalisiert ist (Abb. 3a). In NKR-P1_deglyco kann eine einzelne GlcNAc-Einheit, die bei Asn169 verbleibt, in allen acht NKR-P1-Ketten gut identifiziert werden. Interessanterweise nehmen die lokalisierten ersten GlcNAc-Einheiten, die an Asn116 in NKR-P1_glyco verknüpft sind, und die überlappenden GlcNAc-Einheiten an Asn116 und Asn157, die in NKR-P1_deglyco verbleiben, an Dimerisierungskontakten mit Resten der Helices α1 und Regionen β2, L1 und β2' der gegenüberliegenden Untereinheit teil des NKR-P1-Homodimers (Abb. 3b). In NKR-P1_glyco stabilisieren fünf Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Asn116:GlcNAc und der gegenüberliegenden Untereinheit das Helix-α1-zentrierte Homodimer (Ergänzungstabelle 1). Die Kontaktoberfläche zwischen der gegenüberliegenden Kette von NKR-P1 und der lokalisierten GlcNAc-Einheit beträgt etwa 125 Å2.

In NKR-P1_deglyco kann die Dichte an der Homodimer-Grenzfläche die verbleibende GlcNAc-Einheit von entweder Asn116 einer Kette oder Asn157 der gegenüberliegenden Kette des NKR-P1-Dimers aufnehmen (Einzelheiten siehe Methoden, Tabelle 1 und Abb. 3c). Umgekehrt ist in NKR-P1_glyco die erste GlcNAc-Einheit bei Asn116 hinsichtlich der Elektronendichte in beiden Ketten A und B des NKR-P1-Dimers gut definiert, während bei Asn157 keine Elektronendichte für die Glykosylierung gefunden wurde. Dies legt nahe, dass die Glykosylierung an Asn116 oder Asn157 zwar zur Dimerbildung beitragen kann, die Dimerisierung jedoch durch sterische Hinderung beeinträchtigt werden könnte, wenn beide N-Glykane gleichzeitig vorhanden sind. Um diese Hypothese zu testen, exprimierten wir die NKR-P1-S159A-Mutante und hoben so die Glykosylierung von Asn157 auf. Die Gesamtfaltung der Mutante ist vergleichbar mit der des Wildtyps NKR-P1, wie durch CD-Spektroskopie beurteilt (ergänzende Abbildung 3a). Tatsächlich wies das mutierte Protein bei der Analyse durch analytische Ultrazentrifugation erhebliche Mengen an oligomeren Spezies auf (ergänzende Abbildung 3b), wohingegen die Wildtyp-NKR-P1-Ektodomäne rein monomer ist . Somit kann die Heterogenität der Glykosylierung die Neigung von menschlichem NKR-P1 zur Dimerisierung und damit seine Fähigkeit, multimere Komplexe mit LLT1 zu bilden, beeinflussen.

Die Kristallstruktur des NKR-P1:LLT1-Komplexes wird durch deglykosylierte NKR-P1- und LLT1-Ektodomänen gebildet. Die asymmetrische Einheit des Kristalls enthält einen Komplex aus dimerem NKR-P1 mit dimerem LLT1 und einem zusätzlichen Dimer von NKR-P1 (Abb. 4a). Diese NKR-P1-Dimere haben die gleiche Helix-α1-zentrierte Dimerisierungsschnittstelle wie die Strukturen der oben beschriebenen ungebundenen NKR-P1-Dimere (Abb. 2b). Das LLT1-Dimer behält den erwarteten Helix-α2-zentrierten Dimerisierungsmodus bei (Abb. 2c), der mit dem zuvor für ungebundene LLT1-Strukturen beschriebenen identisch ist. LLT1 weist deutlich identifizierbare GlcNAc-Einheiten an den Resten Asn95 und Asn147 auf. Die in der Elektronendichte des Komplexes beobachtete NKR-P1-Glykosylierung stimmt mit der in der NKR-P1_deglyco-Struktur identifizierten Glykosylierung überein.

a Die Gesamtorganisation der komplexen Kristallstruktur. Das LLT1-Dimer (grün/zitronengelb) kontaktiert das NKR-P1-Dimer, das aus den blauen und cyanfarbenen Monomeren besteht. Das zweite blau-cyanfarbene NKR-P1-Dimer ist durch Kristallsymmetrie mit dem ersten verwandt. Das cyanfarbene NKR-P1-Monomer interagiert mit LLT1 im primären Interaktionsmodus, während das blaue NKR-P1-Monomer LLT1 über die sekundäre Interaktionsschnittstelle interagiert. Ein schwarzes Sternchen markiert den gegenseitigen Zubehörkontakt von NKR-P1, der im Primär- und Sekundärmodus gebunden ist. Darüber hinaus enthält die asymmetrische Einheit des Kristalls ein weiteres NKR-P1-Dimer (rosa/magenta), dem der Kontakt mit LLT1 fehlt. b Gesamtvergleich der Struktur des dimeren KACL (lila) im Komplex mit zwei NKp65-Monomeren (rot; https://doi.org/10.2210/pdb4IOP/pdb) und der Struktur des LLT1-Dimers (grün/zitronengelb) mit den beiden interagierende NKR-P1-Moleküle im primären (Cyan, linke Seite) und sekundären (blau, rechte Seite) Bindungsmodus. Der Vergleich nur mit den primären oder sekundären NKR-P1:LLT1-Interaktionsmodi wird im unteren Abschnitt hervorgehoben (beide in einer Seitenansicht mit 90°-Y-Achsen-Rotation). c, d NKR-P1:LLT1 primäre und sekundäre Interaktionsschnittstellen. Kontaktreste im Umkreis von 5 Å sind gelb gefärbt. Aminosäuren, die die vier stärksten Kontakte bilden, werden für den primären Modus rot und für den sekundären Modus magenta hervorgehoben.

Das LLT1-Homodimer bindet seinen Partner bivalent, dh ein Dimer interagiert mit zwei NKR-P1-Dimeren, die durch kristallographische Symmetrie miteinander verbunden sind: Jedes LLT1-Monomer bindet an eine andere Untereinheit eines bestimmten NKR-P1-Homodimers (Abb. 4a). Es gibt keine offensichtliche induzierte Anpassung der Bindungspartner – der RMSD der Cα-Atome zwischen den nicht interagierenden und den interagierenden NKR-P1-Dimeren (NKR-P1_glyco und der Komplex) beträgt 0,5 Å und der von LLT1 (https://doi .org/10.2210/pdb4QKI/pdb und der aktuelle Komplex) beträgt 0,7 Å. Darüber hinaus tragen die N-verknüpften Glykosylierungsketten nicht direkt zur Wechselwirkung bei.

NKR-P1 und LLT1 stellen in dieser Struktur zwei Arten von Kontakten her – den primären (LLT1-Kette B:NKR-P1-Kette D) und den sekundären (LLT1-Kette A:NKR-P1-symmetriebezogene Kette C) Interaktionsmodus. Der primäre Interaktionsmodus passt gut zur Struktur des homologen menschlichen NKp65:KACL-Komplexes (https://doi.org/10.2210/pdb4IOP/pdb)37 – der RMSD der Cα-Atome der beiden Komplexe beträgt 1,3 Å (eine Kette des Rezeptor und jeweils eine Kette des Liganden, Abb. 4b, unten links). In ähnlicher Weise stimmt die beobachtete Interaktionsschnittstelle in der Struktur von Maus-NKR-P1B im Komplex mit MCMV-Immunevasin m12 mit dem primären Modus in der vorliegenden Struktur des menschlichen NKR-P1-Komplexes überein, obwohl die vom m12-Protein abgedeckte Fläche erheblich größer ist (ergänzende Abbildung). . 1b, c)41. Die kürzlich beschriebene Struktur des Maus-NKR-P1B:Clrb-Komplexes (https://doi.org/10.2210/pdb6E7D/pdb)42 zeigte auch eine für beide NKR-P1-Rezeptoren gemeinsame Interaktionsschnittstelle (ergänzende Abbildung 2b, c). Die im zweiten Interaktionsmodus des NKR-P1:LLT1-Komplexes beobachtete Rezeptor:Ligand-Anordnung ist jedoch einzigartig und unterscheidet sich von allen bekannten homologen Komplexen in der Ligandenorientierung (Abb. 4b, unten rechts und ergänzende Abb. 2b).

Die Interaktionsschnittstellen des menschlichen NKR-P1, die sowohl an primären als auch an sekundären Interaktionsmodi beteiligt sind, sind sehr ähnlich. Sie werden hauptsächlich durch membrandistale Reste der L0-, L3-, L5- und L6-Schleifen sowie durch β3- und β4-Stränge gebildet (Abb. 4c, d), wodurch eine flache Oberfläche für die Interaktion mit LLT1 entsteht. Im Gegensatz dazu unterscheiden sich in LLT1 die primären und sekundären Interaktionsschnittstellen erheblich, obwohl sie nur wenige Reste gemeinsam haben. Während die Schleifen L0', L0, L3, L5, L6 und die Stränge β3 und β4 das primäre Interaktionsfeld von LLT1 bilden (Abb. 4c), sind Reste der Schleifen L2 und L5, Strang β2" und Helix α2 daran beteiligt zweite Interaktionsschnittstelle (Abb. 4d). Bei beiden Interaktionsmodi werden die membrannahen Teile des Rezeptors und des Liganden auf gegenüberliegenden Seiten des Komplexes platziert, wodurch ein plausibles Modell für die Interaktion zwischen zwei benachbarten Zellen entsteht.

Der primäre Wechselwirkungsmodus wird durch neun direkte und mehrere wasservermittelte Wasserstoffbrückenbindungen zusätzlich zu zwei ladungsgestützten und π-π-Stapelwechselwirkungen (Tyr201-Arg175) mit einer gesamten Kontaktoberfläche von ca. 800 Å2 (Ergänzungstabelle 1). Die vier stärksten Bindungen treten zwischen den NKR-P1-Resten Arg181, Tyr201, Lys148 und Ser199 und den LLT1-Resten Glu179, Glu162, Ser129 bzw. Tyr177 auf (Abb. 4c). Der zweite Wechselwirkungsmodus wird durch fünf direkte Wasserstoffbrückenbindungen, zwei ladungsgestützte und eine hydrophobe (LLT1:Pro156 – NKR-P1:Ala149, Leu151) Wechselwirkung, mit einer gesamten Kontaktoberfläche von ca. 550 Å2 (Ergänzungstabelle 1). Die drei stärksten Bindungen treten zwischen den NKR-P1-Resten Asp147, Ser199 und Arg181 und den LLT1-Resten Arg153, Lys169 bzw. Asn120 auf (Abb. 4d).

Neben der Interaktion mit LLT1 haben im primären und sekundären Modus gebundene NKR-P1-Dimere auch einen nicht vernachlässigbaren gegenseitigen akzessorischen Kontakt (NKR-P1-Kette D und NKR-P1-Kette C in symmetriebezogener Position, Csym). Die Grenzflächenfläche beträgt 440 Å2 und wird durch sieben direkte Wasserstoffbrückenbindungen hergestellt (Ergänzungstabelle 1). Über der Grenzfläche ragen vier Reste empor: Asn143 und Arg146 der Kette D sowie Asn174 und Asn176 der Kette Csym (keiner der Asparaginreste ist eine Glykosylierungsstelle). Die Schnittstelle verfügt außerdem über mehrere wasservermittelte Kontakte.

Um die Größe und Form des NKR-P1:LLT1-Komplexes in Lösung zu charakterisieren, haben wir analytische Ultrazentrifugation (AUC), mikroskalige Thermophorese (MST) und Kleinwinkel-Röntgenstreuung gekoppelt mit Größenausschlusschromatographie (SEC-SAXS) durchgeführt ) Experimente. Die erfassten AUC-Daten sind konzentrationsabhängig und spiegeln die dynamische Natur dieses interagierenden Systems wider, ähnlich den Ergebnissen der SEC-SAXS-Messungen. Die freie menschliche NKR-P1-Ektodomäne ist monomer und weist einen Sedimentationskoeffizienten s20,w von 2,1 S auf, was einer geschätzten Molekülmasse von 18 kDa entspricht, was genau dem erwarteten Wert von 17,5 kDa entspricht. Die LLT1-Ektodomäne bildet ein stabiles nichtkovalentes Dimer (2,9 S), das nicht in Monomere dissoziiert, außer in sehr geringer Konzentration, wie zuvor beschrieben43,50. Wenn die Beladungskonzentration der äquimolaren NKR-P1:LLT1-Mischung erhöht wird, erhöht sich auch der Sedimentationskoeffizient des Komplexes und erreicht einen s20,w-Wert von 3,7 S bei der höchsten analysierten Konzentration (ergänzende Abbildung 3c). Wenn dieser Wert um die Nichtidealität korrigiert wird, die durch die hohe verwendete Proteinbeladungskonzentration (18 mg/ml) verursacht wird, entspricht er einem geschätzten Sedimentationskoeffizienten s020,w bei Null-Proteinkonzentration von 4,5 S und einem mäßig verlängerten Partikel mit ungefährem Wert Abmessungen von 10–15 × 4–5 × 4–5 nm. Das lässt sich gut mit den Abmessungen von 8–10 × 5–6 × 4–5 nm vergleichen, die für die möglichen NKR-P1:LLT1-Wechselwirkungsanordnungen erwartet werden, die in der Kristallstruktur des Komplexes beobachtet werden, d. h. Monomer:Dimer:Monomer oder Dimer:Dimer (beachten Sie, dass). Während N-Glykanketten in der Struktur des deglykosylierten Komplexes nicht vorhanden sind, waren sie bei allen unseren Analysen in Lösung vorhanden.

Um zu verstehen, ob der in der Kristallstruktur beobachtete sekundäre Wechselwirkungsmodus auch in der Lösung genutzt wird, haben wir eine N120R-, R153E- und K169A-Dreifachmutante von LLT1 (LLT1SIM) entworfen und damit die drei stärksten Kontakte in der sekundären Wechselwirkungsschnittstelle von LLT1 abgeschafft (Abb. 4d). Der LLT1SIM-Mutant wurde auf die gleiche Weise wie der Wildtyp-LLT1 exprimiert und gereinigt und zeigte ein vergleichbares CD-Spektrum (ergänzende Abbildung 3a). Die Konzentrationsreihe der äquimolaren NKR-P1:LLT1SIM-Mischung erreichte einen s20,w-Wert von 3,3 S (entsprechend einem geschätzten s020,w-Wert von 3,9 S), was deutlich die Bildung des Komplexes mit einer kleineren Größe im Vergleich zum Wildtyp-NKR zeigt -P1:LLT1-Gemisch, möglicherweise eine Monomer:Dimer-Anordnung (Ergänzende Abbildung 3d). Durch Integration der gesamten c(s)-Kurven der kontinuierlichen Größenverteilung und Auftragen der resultierenden gewichtsmittleren S-Werte gegen die verwendeten Konzentrationen der LLT1-Proteine ​​wurden Bindungsisothermen für beide Verdünnungsreihen konstruiert und zunächst am besten an das einfachste Heteroassoziationsbindungsmodell angepasst A + B ⇔ AB, wobei A das LLT1-Dimer und B das NKR-P1-Monomer ist (ergänzende Abbildung 4a). LLT1SIM zeigte eine etwa dreifach schwächere Gesamtaffinität als der Wildtyp-LLT1, was durch unabhängige MST-Analyse unter Verwendung von fluoreszenzmarkiertem NKR-P1, titriert mit LLT1 oder LLT1SIM, weiter bestätigt wurde (ergänzende Abbildung 4b). Um den Unterschied zwischen Wildtyp-LLT1 und LLT1SIM hinsichtlich der Bindung des zweiten NKR-P1-Monomers zu analysieren, passen wir die Daten auch mithilfe des Modells A + B ⇔ AB + B ⇔ BAB am besten an (ergänzende Abbildung 4c). Während dies für den Wildtyp-LLT1 die Anpassung verbesserte und zwei unterschiedliche KD-Werte lieferte, die möglicherweise primären und sekundären Interaktionsmodi entsprechen, blieben die angepassten KD-Werte für LLT1SIM unverändert, was die Bindung des zweiten NKR-P1-Monomers widerlegte. Wenn die AUC- und MST-Daten global zusammen mit den auf die zuvor am besten angepassten Werte festgelegten AUC-Parametern angepasst wurden, konnten die LLT1SIM-MST-Daten gleichermaßen gut mit AB- und BAB-Modellen angepasst werden. Im Gegensatz dazu ist die Anpassung für das AB-Modell im Fall von Wildtyp-LLT1 schlecht (ergänzende Abbildung 4d). Zusammengenommen zeigen unsere Daten, dass die sekundäre Interaktionsschnittstelle nicht nur ein Kristallkontakt ist, sondern erheblich zur Gesamtaffinität der NKR-P1:LLT1-Interaktion beiträgt.

Angesichts der schnellen Kinetik dieser Wechselwirkung, der langen Zeitskala des Experiments und der Tatsache, dass die Proteinkonzentration entlang der Sedimentationsgrenze stetig abnimmt, ist es unwahrscheinlich, dass im AUC-Sedimentationsgeschwindigkeitsexperiment Anordnungen noch höherer Ordnung beobachtet werden. Die Kristallstruktur des NKR-P1:LLT1-Komplexes lässt jedoch auf eine kettenartige Anordnung von Rezeptor:Liganden-Dimeren schließen. Um festzustellen, ob solche Anordnungen in der Lösung vorhanden sind, führten wir eine SEC-SAXS-Analyse der äquimolaren NKR-P1:LLT1-Mischung bei einer Beladungskonzentration von 15 mg/ml durch. Im SEC-SAXS-Experiment wurden zwei Absorptionspeaks bei 280 nm beobachtet, die zwei unterschiedlichen SAXS-Peaks entsprechen (Abb. 5). Zur weiteren Analyse haben wir vier Datenintervalle vom ersten Peak und zwei Datenintervalle vom zweiten Peak abgetastet und die Daten innerhalb dieser Intervalle separat zusammengeführt (Abb. 5 und ergänzende Abb. 5). Der aus dem SAXS-Signal berechnete Gyrationsradius nimmt mit dem Retentionsvolumen stetig ab. Zwei kleine Plateaus im Hauptpeak deuten auf ein dynamisches Gleichgewicht zwischen Komplexbildung und -dissoziation hin (Abb. 5). Infolgedessen konnten die zusammengeführten Streukurven nicht gut an Streukurven angepasst werden, die aus einer einzelnen Struktur des NKR-P1:LLT1-Komplexes oder seiner Komponenten simuliert wurden. Daher haben wir Modelle von Anordnungen des NKR-P1:LLT1-Komplexes in unterschiedlichen Längen (Anzahl der Proteinketten) konstruiert und dabei alle möglichen Permutationen der Reihenfolge der Moleküle berücksichtigt, wobei nur primäre, nur sekundäre oder beide Wechselwirkungsmodi abwechselnd verwendet wurden . Die resultierende Bibliothek all dieser Modelle (insgesamt 49 verschiedene Strukturen) wurde dann von der OLIGOMER-Software verwendet, um die abgetasteten Datenintervalle (ergänzende Abbildung 5) sowie die einzelnen experimentellen SAXS-Kurven (ergänzende Daten 1) bestmöglich anzupassen. Durch diesen Ansatz passen die abgetasteten SAXS-Daten recht gut zu den überlagerten berechneten Streuungskurven von Gruppen von NKR-P1:LLT1-Komplexstrukturen mit höherer Stöchiometrie (χ2 1,29–3,47; beachten Sie, dass die vollständige Glykosylierung nicht modelliert wurde, aber zur Streuung beitrug ; Ergänzende Abb. 5). Dem aus den SAXS-Daten berechneten kontinuierlich abnehmenden Gyrationsradius folgend, nimmt auch die Stöchiometrie der am besten passenden Strukturen des NKR-P1:LLT1-Komplexes mit dem Retentionsvolumen stetig ab. Die SAXS-Streuungskurve des ersten Peaks passt am besten zu zwei bis drei LLT1-Dimeren, die in einem kettenartigen Oligomer mit zwei bis drei NKR-P1-Dimeren interagieren, während die Kurve des zweiten Peaks zu einem LLT1-Dimer führt, das mit einem NKR-P1 interagiert Dimer im Primär- oder Sekundärmodus. Insbesondere bevorzugte OLIGOMER im Allgemeinen Baugruppen, die primäre und sekundäre Interaktionsmodi kombinieren, gegenüber Modellen mit nur den primären oder sekundären Modi.

Überlagerung des Größenausschlusschromatographieprofils (schwarze Linie) und des SAXS-Streusignals (rote Linie) für die äquimolare NKR-P1:LLT1-Mischung bei einer Beladungskonzentration von 15 mg/ml. Beide Signale zeigen zwei deutliche Spitzen. Für jeden gesammelten SAXS-Rahmen wurde der Gyrationsradius mit AUTORG (blaue Kreise) berechnet. Für die weitere Analyse wurden sechs Intervalle der SAXS-Daten ausgewählt und separat zusammengeführt (Frames 355–367, 368–378, 379–388, 389–399, 431–440, 481–491; als Säulen mit diagonaler Schraffur bezeichnet). Die SAXS-Streukurve (a), das Kratky-Diagramm (b) und die Paarabstandsverteilungsfunktion (c) für die Intervalle 389–399 und 481–491 sind im Einschub zur Datenqualitätsbewertung der zusammengeführten Daten dargestellt. Alle sechs zusammengeführten Datenintervalle wurden dann einzeln von OLIGOMER analysiert (Supplementary Data 1 und Supplementary Abb. 5). Beugungsdaten aus dem SEC-SAXS-Experiment wurden hinterlegt (https://doi.org/10.17632/268ww2m4j3.1)81.

Um die biologische Relevanz dieser Komplexe höherer Ordnung im Kontext einer lebenden Zelle zu beantworten, führten wir Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopiestudien mit einer NKR-P1-exprimierenden Zelllinie durch und quantifizierten die Oberflächenverteilung von NKR-P1 in Bezug auf LLT1 oder LLT1SIM-Bindung. NKR-P1-Transfektanten voller Länge, die mit dem piggyBac-System erzeugt wurden, wurden dazu gebracht, den Rezeptor in einer begrenzten Dichte zu exprimieren, um eine Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie zu ermöglichen. Die Zellen wurden dann in Gegenwart oder Abwesenheit von löslichem LLT1 oder LL1SIM inkubiert, fixiert und mit Anti-NKR-P1 AlexaFluor® 647 mAb markiert. Es wurden Bilder der direkten stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) aufgenommen und mithilfe der Voronoi-Tessellationsclusteranalyse die Wirkung von löslichem LLT1 auf die nanoskalige Organisation von NKR-P1 auf der Zelloberfläche beurteilt (Abb. 6a). In Abwesenheit von LLT1 entdeckten wir Cluster von Fluoreszenzereignissen mit einer durchschnittlichen Fläche von 1870 ± 777 nm2 (Abb. 6b) und einem durchschnittlichen Durchmesser von 41 ± 7 nm (Abb. 6c), meist Cluster von Ereignissen mit einem Durchmesser im Bereich von 10 bis 40 nm (Abb. 6d), was auf doppelt markierte NKR-P1-Homodimere mit AlexaFluor® 647 hinweist (ca. 6 nm + 10 nm Verknüpfungsfehler pro mAb ± 15 nm Lokalisierungsgenauigkeit; bitte beachten Sie die scheinbare Größe fluoreszierender Cluster entspricht nicht direkt der Größe der Rezeptorcluster). Durch die Zugabe von löslichem LLT1 wurden die Durchmesser der beobachteten Ereigniscluster (auf 47 ± 6 nm; p < 0,0001, Abb. 6c, d), die Fläche (2713 ± 1180 nm2; p < 0,0001, Abb. 6b) und die beobachteten Ereigniscluster signifikant erhöht Anzahl der in den Clustern erkannten Ereignisse (38, 8 ± 12, 3; p <0, 0001, Abb. 6e), während die Dichte der Ereignisse in den Clustern erwartungsgemäß unverändert blieb (Abb. 6f). Darüber hinaus war die Wirkung der LLT1SIM-Zugabe auf die nanoskalige Organisation von NKR-P1 statistisch nicht von der Negativkontrolle zu unterscheiden, unterschied sich jedoch signifikant von der Wirkung der LLT1-Zugabe. Basierend auf dem relativen Vergleich dieser drei unterschiedlichen Rezeptorzustände (frei, LLT1-gebunden und LLT1SIM-gebunden) können wir davon ausgehen, dass die sekundäre Interaktionsschnittstelle in LLT1 notwendig ist, um bei Interaktion nanoskalige NKR-P1-Cluster zu bilden. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Gesamtdichte der Ereignisse pro innerer Zelloberfläche (ausgewerteter Bereich) festgestellt (Abb. 6g), was auf stabile Expressionsniveaus von NKR-P1 während der gesamten Messung hinweist. Folglich nimmt die Größe von NKR-P1-Nanoclustern zu (über eine Homodimereinheit hinaus), nicht aufgrund von Unterschieden in den NKR-P1-Expressionsniveaus, sondern weil LLT1 zwei oder mehr NKR-P1-Homodimere vernetzt.

Stabile NKR-P1-Transfektanten wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von löslichem LLT1 oder LLT1SIM inkubiert und die Zelloberflächenverteilung von NKR-P1 wurde durch hochauflösende Mikroskopie überwacht. a Repräsentative Hellfeld- (BF) und dSTORM-Bilder von stabilen NKR-P1 HEK293-Transfektanten voller Länge auf PLL-beschichteten Objektträgern, inkubiert ohne (schwarz) oder mit LLT1 (rot) oder LLT1SIM (grün), fixiert und gefärbt mit AlexaFluor® 647-markiert Anti-NKR-P1-mAb; Maßstabsbalken repräsentieren 5 µm. Die 10 µm2 großen Regionen (rote Kästchen in dSTORM-Bildern) werden vergrößert und mit entsprechenden Clustern von Fluoreszenzereigniskarten (CoE) und Binärkarten angezeigt; Maßstabsbalken repräsentieren 1 µm. b–g Analyse der relativen Änderungen der NKR-P1-Verteilung in voller Länge, die durch das Vorhandensein seiner löslichen Liganden LLT1 oder LLT1SIM hervorgerufen werden: durchschnittliche Ereignisclusterfläche (b), durchschnittliche Ereignisclusterdurchmesser (c), Größenverteilungen der Ereigniscluster Durchmesser überlagert mit Poisson-Verteilungsfunktionen (d), durchschnittliche Ereignisse pro Ereigniscluster (e), Dichte der erkannten Ereignisse pro Ereigniscluster (f) und Gesamtdichte der erkannten Ereignisse (g). In b, c und e, f stellt jeder aufgetragene Punkt den Mittelwert dar, der aus der Analyse der gesamten Innenoberfläche einer einzelnen Zelle erhalten wurde. Die Mitte des Boxplots stellt den Gesamtmittelwert dar, die Grenzen der Box stellen den Interquartilbereich dar und die Whisker stellen ±SD dar. Die Daten stammen von n = 45 NKR-P1+-Kontrollzellen und n = 41 oder n = 47 NKR-P1+-Zellen, die mit LLT1 oder LLT1SIM in sieben bzw. vier unabhängigen Experimenten inkubiert wurden. Einfaktorielle ANOVA mit Bonferroni-Korrektur, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, ns. nicht signifikant. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Als nächstes analysierten wir die Wirkung von löslichem LLT1 oder LLT1SIM auf das Hemmpotenzial von nativem NKR-P1, das auf der Oberfläche frisch isolierter NK-Zellen exprimiert wird, in einem NK-Zell-vermittelten Zytotoxizitätsassay und untersuchten so den Einfluss der durch NKR-P1-Ligandenbindung induzierten Vernetzung auf zellulärer Signalisierung. Aus dem Blut von drei verschiedenen gesunden Spendern isolierte NK-Zellen wurden mit IL-2 aktiviert und mit den K562-Zielzellen in einem Verhältnis von Effektor zu Zielzelle von 40:1 gemischt und 4 Stunden lang mit PBS-Puffer als Negativkontrolle oder mit dem löslichen inkubiert LLT1 oder LLT1SIM (beide in zwei unterschiedlichen Konzentrationen). In Abwesenheit des NKR-P1-Liganden sind K562-Zellen gut anfällig für eine durch NK-Zellen vermittelte Lyse (Abb. 7; PBS-Kontrolle, weniger als 10 % lebende K562-Zellen). Wie erwartet wurde die Lyse in Gegenwart von löslichem LLT1 im Wesentlichen blockiert. Im Gegensatz dazu konnte die LLT1SIM-Variante mit einer mutierten sekundären Interaktionsschnittstelle die durch NK-Zellen vermittelte Zytotoxizität nicht blockieren. Wie von dSTORM auf der Zelloberfläche beobachtet (Abb. 6), vernetzt LLT1SIM NKR-P1 nicht effizient. Diese Mutante kann auch keine Signale über den NKR-P1-Inhibitorrezeptorweg senden. Basierend auf Mikroskopie- und Zytotoxizitätstestdaten kommen wir daher zu dem Schluss, dass die durch LLT1-Ligation ausgelöste NKR-P1-Vernetzung biologisch relevant und für die zelluläre Signalisierung unverzichtbar ist und eine Interaktion sowohl im primären als auch im sekundären Interaktionsmodus erfordert.

NK-Zellen von drei verschiedenen Spendern (blau, rot und grün) und K562-Zielzellen wurden nur mit PBS-Puffer (Negativkontrolle) oder mit den löslichen LLT1- oder LLT1SIM-Proteinen inkubiert, jeweils in Konzentrationen von 50 und 250 µM, entsprechend dem 1× und 5× KD-Werte, wie von der AUC für den primären Interaktionsmodus analysiert (vgl. ergänzende Abbildung 4). Balkendiagramme stellen die Mittelwerte lebender K562-Zellen in jedem Zustand dar, wobei die Ergebnisse einzelner Experimente als leere Kreise dargestellt sind und die Whiskers ±SD darstellen. Gegebenenfalls wurden die Daten mittels einer einfaktoriellen ANOVA statistisch ausgewertet. Wenn man p < 0,05 als statistisch signifikant betrachtet, unterscheidet sich die Hemmwirkung von löslichem LLT1 deutlich von LLT1SIM, das sich nicht von der Kontrollbedingung ohne NKR-P1-Ligand unterscheidet. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Derzeit gibt es nur zwei ähnliche CTL:CTL-NK-Zellrezeptor:Ligand-Komplexe mit bekannter 3D-Struktur: menschliches NKp65:KACL37 und Maus-NKR-P1B:Clrb42. Diese homologen Komplexe ähneln topologisch dem primären Interaktionsmodus des NKR-P1:LLT1-Komplexes (Abb. 4b). Die Sequenzidentität des extrazellulären Teils von NKR-P1 mit NKp65 beträgt 33 % und mit murinem NKR-P1B 42 %. Im Vergleich dazu beträgt die Sequenzidentität des extrazellulären Teils von LLT1 mit KACL 49 % und mit murinem Clrb 51 %. Die Struktur des menschlichen NKp65:KACL-Komplexes besteht aus zwei monomeren NKp65-Einheiten, die getrennt und symmetrisch mit einem dimeren KACL-Liganden interagieren. Die Kristallstruktur des murinen NKR-P1B:Clrb-Komplexes zeigt zwei Clrb-Dimere, die mit einem dazwischen platzierten NKR-P1B-Dimer interagieren (jedes Clrb-Dimer interagiert mit einer der beiden NKR-P1B-Ketten). Die Anordnung des Mauskomplexes ähnelt der Struktur des hier vorgestellten NKR-P1:LLT1-Komplexes, abgesehen von der Tatsache, dass der Mauskomplex symmetrisch ist, während wir zwei unterschiedliche Bindungsschnittstellen beobachten, den primären und den sekundären Interaktionsmodus von LLT1.

Trotz unterschiedlicher oligomerer Formen der NKR-P1:LLT1-, NKR-P1B:Clrb- und NKp65:KACL-Komplexe ist die primäre Rezeptor:Ligand-Wechselwirkung in allen drei Fällen auf der Ebene der Monomer:Monomer-Überlagerung – dem Rezeptor:Ligand-Paar – ähnlich Monomere überlappen sich grundsätzlich entlang der gesamten Kette. Die strukturell am stärksten konservierten Regionen sind im Allgemeinen sequenziell konservierte β-Faltblätter im Kern der Proteine. Ergänzende Abbildung 6a zeigt in Rot die Fragmente mit konservierter 3D-Position, Aminosäuretyp und Länge von mindestens drei Aminosäuren. Solche Kriterien werden von diesen Fragmenten erfüllt: in Liganden – KCFYFS (in menschlichen LLT1-Resten 85–90), NWT (95–97), WIGL (132–135), WKW (143–145) und WICSK (182–186). und in Rezeptoren – WIGL (in den menschlichen NKR-P1-Resten 153–156) und ICQ (209–211). Daher scheint es, dass für ihre Interaktion die gegenseitige Ausrichtung von Rezeptor und Ligandengerüst wichtiger ist als die eigentliche Interaktionsschnittstelle.

Wir stellten fest, dass in mindestens zwei der drei homologen Komplexe nur drei Aminosäure-Wechselwirkungspaare in der Wechselwirkungsschnittstelle konserviert waren. Sie sind um die Reste Tyr165-Tyr171-Phe148, Arg175-Arg181-Arg158 und Tyr177-Tyr183-Phe160 des Liganden versammelt (Ergänzungstabelle 2 und ergänzende Abbildung 6a). Die Argininreste bilden in Clrb- und KACL-Fällen äquivalente Wasserstoffbrückenbindungen. In LLT1 nimmt das Arginin eine andere Konformation an und bildet eine intramolekulare Wasserstoffbrücke mit Asn183. Der primäre Interaktionsmodus in NKR-P1:LLT1 beruht hauptsächlich auf Hauptkettenkontakten, die eine schnelle Kon/Koff-Kinetik ermöglichen, was die zuvor veröffentlichten SPR-basierten Ergebnisse39,40 und unsere AUC-Analyse bestätigt. Daher wird in allen drei Fällen ein topologisch ähnlicher Komplex gebildet, obwohl der zugrunde liegende intermolekulare Erkennungsmechanismus von der tatsächlichen Faltung und Aminosäurezusammensetzung halbunabhängig ist (ergänzende Abbildung 6b). Der sekundäre Wechselwirkungsmodus ist jedoch einzigartig für den NKR-P1:LLT1-Komplex und wird in den anderen verwandten Komplexen nicht gefunden.

Y. Li and coworkers reported that the orientation of NKp65 bound to its ligand precludes the putative α2-centered dimerization of NKp6537. Similarly, a hypothetical NKp65 α1-centered dimer is also implausible based on steric hindrance and the lack of stabilizing interactions. This observation contrasts with the α1-centered dimerization of NKR-P1 present in both its unbound and complexed crystal structure. Interestingly, the single-nucleotide polymorphism (SNP) c.503 T > C of the human KLRB1 gene, causing the substitution of isoleucine 168 for threonine in the NKR-P1 CTLD, was reported to have a 37% frequency of the Thr168 alleleC polymorphism in the human KLRB1 gene alters ligand binding and inhibitory potential of CD161 molecules. PLoS One 10, e0135682 (2015)." href="/articles/s41467-022-32577-6#ref-CR51" id="ref-link-section-d57927382e3335">51. The authors showed that the Thr168 isoform of NKR-P1 has a lower affinity to LLT1 and a weaker inhibitory effect on NK cells. They proposed that Ile168 forms a part of the interaction interface between NKR-P1 and LLT1, directly affecting LLT1 recognition by NKR-P1C polymorphism in the human KLRB1 gene alters ligand binding and inhibitory potential of CD161 molecules. PLoS One 10, e0135682 (2015)." href="/articles/s41467-022-32577-6#ref-CR51" id="ref-link-section-d57927382e3339"> 51. Die Struktur des NKR-P1-Homodimers zeigt jedoch, dass Ile168 an der Dimerisierungsschnittstelle statt an der Membran-Distal-Interaktionsschnittstelle gefunden wird – genauer gesagt in einer kleinen hydrophoben Tasche innerhalb der Dimerisierungsschnittstelle (Abb. 3d). Daher schlagen wir vor, dass der durch c.503 T > C SNP verursachte Ersatz des unpolaren Isoleucinrests durch polares Threonin indirekt die Bindungsaffinität beeinflusst, da dieser Ersatz das α1-zentrierte NKR-P1-Homodimer destabilisiert. Die Glykosylierung hat häufig einen erheblichen Einfluss auf die Homooligomerisierung des Rezeptors, wie kürzlich beispielsweise für den NK-Zellaktivierungsrezeptor NKp3052 nachgewiesen wurde. Die Homodimerisierung von NKR-P1 wird auch durch seine Glykane reguliert; insbesondere die auf Asn116 und Asn157 vorhandenen Glykane (Abb. 3b). An diesen Resten vorhandene Kernglycanketten tragen teilweise zur α1-zentrierten Dimerisierungsschnittstelle bei, aber gleichzeitig kollidieren die Glykane miteinander. Infolgedessen wird die Stabilität des α1-zentrierten NKR-P1-Homodimers verbessert, indem die N-Glykosylierung an Asn157 aufgehoben wird, sodass nur das Asn116-Glykan an der Dimerschnittstelle verbleibt (ergänzende Abbildung 3b). Interessanterweise ist ein SNP mit ca. 470 A > G, der eine N157S-Mutation verursacht, auch in der Variationsdatenbank des menschlichen Genoms aufgeführt. Die klinische Bedeutung der N157S-Mutation wurde jedoch noch nicht untersucht, obwohl sie die NKR-P1-Signalisierung durch die Stabilisierung ihres ligandengebundenen Zustands erheblich beeinflussen könnte. Der oligomere Zustand des Rezeptors könnte somit die gesamte NKR-P1:LLT1-Bindungsaffinität modulieren. Der NKp65:KACL-Komplex zeichnet sich durch seine hohe Affinität aus (Kd ~ 0,67 nM)37 – ca. 3000-mal stärker als das von NKp80:AICL (Kd ~ 2,3 µM)9 und 70.000–130.000-mal stärker als das von NKR-P1:LLT1 (Kd ~ 48 µM39; diese Studie 90 µM). Aufgrund der außergewöhnlich hohen NKp65:KACL-Bindungsaffinität ist möglicherweise jede mutmaßliche α1-zentrierte Dimerisierungsschnittstelle der Vorfahren in NKp65 verloren gegangen. Im Gegensatz dazu haben sich die NKR-P1- und NKp80-Rezeptoren möglicherweise so entwickelt, dass sie ihre geringe Affinität zu ihren Liganden kompensieren, indem sie die α1-zentrierte Dimerisierung nutzen und einen erhöhten Aviditätseffekt ermöglichen.

Die von J. Kamishikiryo durchgeführte und von S. Kita und ihren Mitarbeitern aktualisierte SPR-Analyse von Einzelrestmutanten beider Bindungspartner auf der Grundlage der veröffentlichten LLT1-Struktur39,40 identifizierte mehrere Schlüsselreste von NKR-P1 und LLT1, die für ihre Interaktion essentiell sind und schlug mehrere Paare interagierender Reste vor (Ergänzungstabelle 3). Die mutierten Reste, die in diesen SPR-Studien nachteilige oder mäßige nachteilige Auswirkungen auf die Bindung hatten, finden sich hauptsächlich in der primären Interaktionsschnittstelle (Abb. 1 und Ergänzungstabelle 3) – in LLT1: Tyr165, Asp167, Lys169, Arg175, Arg180 und Lys181. und in NKR-P1: Arg181, Asp183, Glu186, Tyr198, Tyr201 und Glu205. Allerdings stimmen die vorgeschlagenen Wechselwirkungspaare nicht immer mit der gegenseitigen Orientierung beider Proteine ​​überein, die in der vorliegenden Kristallstruktur des NKR-P1:LLT1-Komplexes beobachtet wird. Beispielsweise stimmen die vorgeschlagenen LLT1/NKR-P1-Paare Tyr177/Tyr198 und Arg175/Glu200 gut mit unseren beobachteten Interaktionspaaren LLT1:Tyr177:OH/NKR-P1:Ser199:O und LLT1:Arg175:N/NKR-P1:Glu200 überein :OE2 bzw. Andererseits ähnelt die vorgeschlagene Paarung von Glu179 aus der LLT1-Schleife L6 mit Ser193 und Thr195 aus der NKR-P1-Schleife L5 nur den Kristallstrukturkontakten von Glu179 mit Arg181 (Schleife L3) und Tyr198 (Strang β4), die sich in der Nähe von NKR-P1 befinden Schleife L5. Im Gegensatz zu den SPR-Studien beobachteten wir keinen Kontakt zwischen Tyr165 und Phe152, obwohl LLT1:Tyr165 in der primären Schnittstelle verwendet wird und Phe152 nahe an der NKR-P1-L0-Interaktionsregion liegt. Schließlich können wir die vorgeschlagene direkte Bindung zwischen LLT1:Lys169 und NKR-P1:Glu205 nicht bestätigen. Obwohl diese Reste im Primärmodus nahe beieinander liegen (der kleinste Abstand beträgt 4,3 Å), bilden sie eindeutig keine zentrale Bindung in der Wechselwirkungsschnittstelle. Darüber hinaus ist die Lys169-Seitenkette im Gegensatz zu allen anderen nahegelegenen Seitenketten mit genau definierten Positionen recht flexibel, was durch die geringe Qualität ihrer Elektronendichtekarte im Primärmodus nahegelegt wird.

Da der in der NKR-P1:LLT1-Struktur beobachtete sekundäre Bindungsmodus eine andere Region von LLT1 als die im primären Bindungsmodus verwendete Region umfasst, stimmt die Ausrichtung von LLT1 und NKR-P1 in diesem Bindungsmodus nicht mit den in vorgeschlagenen Interaktionspaaren überein die SPR-Studien. Ungeachtet dessen ist die NKR-P1-Interaktionsschnittstelle im Primär- und Sekundärmodus sehr ähnlich; Daher sind einige der zuvor vorgeschlagenen NKR-P1-Wechselwirkungsreste auch im sekundären Modus beteiligt (Arg181, Asp183, Tyr198 und Tyr201). Interessanterweise stellt der Rest LLT1:Lys169 im sekundären Interaktionsmodus mehrere Kontakte mit NKR-P1 (Arg181, Ser199 und Glu200) her. Allerdings wird das zuvor vorgeschlagene Paar Lys169/Glu20539,40 auch in diesem Modus nicht beobachtet, und diese Reste sind sogar noch weiter voneinander entfernt – etwa 11 Å. Das Vorhandensein von Lys169 sowohl an den primären als auch an den sekundären Interaktionsschnittstellen von LLT1 legt nahe, dass dieser Rest eine wichtige Rolle bei der Gesamtkomplexbildung spielt. Dementsprechend würde die zuvor berichtete LLT1-Mutation Lys169Glu39,40 zu einer Co-Lokalisierung mehrerer negativer Seitenketten in der sekundären Schnittstelle führen (Glu200 und Asp183 von NKR-P1 und mutiertes Glu169 von LLT1), was auf eine Störung des NKR hinweist Die in den vorherigen SPR-Experimenten beobachtete -P1:LLT1-Wechselwirkung resultierte höchstwahrscheinlich aus der Schwächung der sekundären und nicht der primären Schnittstelle. Anschließend stellte J. Kamishikiryo die Bindung wieder her, indem er die Glu205Lys-Mutation in NKR-P1 einführte. Basierend auf unserer Struktur würde dieser Effekt durch eine Stärkung der primären Schnittstelle erklärt werden. Somit stimmen die zuvor veröffentlichten SPR-basierten Interaktionsdaten weitgehend mit den zwischen NKR-P1 und LLT1 in der vorliegenden Kristallstruktur beobachteten Interaktionsmodi überein, obwohl einige zuvor vorgeschlagene Interaktionspaare falsch zugeordnet wurden und in keiner der Interaktionsschnittstellen vorhanden sind.

Mehrere Autoren haben zuvor einen Aviditätseffekt der Multimerisierung auf die Wechselwirkung vorgeschlagen, der die geringe Affinität des NKR-P1:LLT1-Komplexes ausgleicht37,40,47. Interessanterweise beobachten wir in der vorliegenden Struktur dieses Komplexes tatsächlich die Bildung einer Kette sich wiederholender NKR-P1- und LLT1-Homodimere. Dieses pseudolineare Multimer hat eine Zickzackform, bei der sich die membrannahen Teile der beiden Proteine ​​auf gegenüberliegenden Seiten befinden (Abb. 8), und es basiert strukturell auf den alternierenden Helix-α1/α2-zentrierten NKR-P1/LLT1-Homodimeren (der kettenbildende Effekt) und die gleichzeitige Beteiligung sowohl primärer als auch sekundärer Wechselwirkungsmodi (sterischer Effekt). Im Gegenteil, ein künstlich konstruiertes multimeres Modell von NKR-P1:LLT1, das nur im Primärmodus aktiv ist, zeigt eine Kette von Homodimeren mit einer nichtlinearen, fast helikalen Konformation (ergänzende Abbildung 6c). Darüber hinaus kollidieren die NKR-P1-Stielregionen sterisch und die LLT1-Stielregionen liegen außerhalb des komplexen Kerns in vielen verschiedenen Richtungen frei. Daher ist es unwahrscheinlich, dass ein solches Multimer mit der Zellmembranverankerung und -bildung innerhalb der Immunsynapse kompatibel ist. NKR-P1:LLT1, das nur im sekundären Modus aktiv ist, würde auch ein helikales Multimer bilden, bei dem sowohl Rezeptor- als auch Ligandenstielregionen in viele verschiedene Richtungen außerhalb des komplexen Kerns zeigen (ergänzende Abbildung 6d). Gleichzeitig erzeugen die benachbarten NKR-P1-Moleküle, wenn sie sowohl im primären als auch im sekundären Wechselwirkungsmodus an das LLT1-Dimer gebunden sind, einen gegenseitigen akzessorischen Kontakt, der einen nicht unerheblichen energetischen Beitrag zur Stabilität der gesamten Anordnung darstellt (Abb. 4a, markiert mit a). schwarzer Stern). Dieser akzessorische Kontakt umfasst eine ähnliche Anzahl und Größe von Wasserstoffbrücken wie die sekundäre Bindungsschnittstelle zwischen NKR-P1 und LLT1 selbst (ergänzende Abbildung 6e) und könnte daher als zusätzliches stabilisierendes Element angesehen werden, das eine Kombination aus primärer und sekundärer Bindung begünstigt Modi und nicht nur einen einzigen davon.

a Representation of four adjacent asymmetric units within the NKR-P1:LLT1 complex crystal, excluding the additional unrelated NKR-P1 dimer. The NKR-P1 (blue and cyan) and LLT1 (green and lemon) dimers alternate in primary (cyan and green) and secondary (blue and lemon) interactions, forming a chain-like structure. The schematic depiction of this arrangement is shown in the inset with the same color code. The black and white triangles represent N-termini positions, pointing behind and in front of the display plane, respectively. b Depiction of the hypothetical arrangement of the chain-like structure upon contact of an NK cell (bottom, blue) with a target cell (top, green) showing the crystal structure of two NKR-P1 dimers (cyan and blue) interacting with two LLT1 dimers (green and lemon) in the primary (cyan and green) and secondary (blue and lemon) modes. The first three N-terminal residues in the structures are highlighted in red. The flexible stalk regions connecting the N-termini and cell membranes are represented as speckled lines of the corresponding color-coding. The view on the right-hand side is clipped for clarity at the plane indicated on the left-hand side view. c Schematic depiction of NKR-P1 extracellular domain dynamics and possible ligand binding arrangements. NKR-P1 is expressed as a disulfide-linked homodimer; however, its CTLDs may undergo conformation change similar to monomer-dimer equilibrium. Such putative equilibrium would be shifted towards monomeric species for the wild-type protein and its I168T allelic variantC polymorphism in the human KLRB1 gene alters ligand binding and inhibitory potential of CD161 molecules. PLoS One 10, e0135682 (2015)." href="/articles/s41467-022-32577-6#ref-CR51" id="ref-link-section-d57927382e3460"> 51. Gleichzeitig würde für die S159A-Variante (linke Seite) eine dimere Anordnung gefördert, die dem in den hier beschriebenen Kristallstrukturen beobachteten nichtkovalenten Dimer entspricht. Ein solches NKR-P1-Dimer könnte dann im zuvor vorgeschlagenen Standardmodell der NK-Zellrezeptor-CTL-Liganden-Wechselwirkung mit dem zugehörigen LLT1-Liganden interagieren (der selbst ebenfalls als Disulfid-verknüpftes Homodimer exprimiert wird und mit seinen CTLDs stabile nichtkovalente Dimere bildet). (Mitte) oder alternieren mit dem dimeren Liganden in der vorgeschlagenen kettenartigen Anordnung basierend auf der Kristallstruktur des NKR-P1:LLT1-Komplexes (rechte Seite).

Um festzustellen, ob solche reißverschlussartigen Oligomere von NKR-P1: LLT1 nicht nur im Kristall und teilweise in Lösung (Abb. 5 und ergänzende Abb. 5), sondern auch auf der Zelloberfläche vorkommen, haben wir Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie verwendet Untersuchen Sie NKR-P1-Transfektanten voller Länge, die mit Anti-NKR-P1 AlexaFluor® 647 mAb markiert sind, in Gegenwart oder Abwesenheit von löslichem LLT1 und LLT1SIM (Abb. 6). Wir beobachteten eine signifikante Zunahme der Größe und Fläche des NKR-P1-Clusters fluoreszierender Ereignisse bei der Zugabe von LLT1, nicht jedoch seiner Mutante im sekundären Interaktionsmodus, LLT1SIM. Obwohl der Versuchsaufbau, bei dem ein Bindungspartner in die Membran eingebettet ist und der andere als löslich dargestellt wird, die biologische Realität des interzellulären Kontakts nicht vollständig beschreibt, gehen wir davon aus, dass die Interaktion auf einen zweidimensionalen Raum zwischen Membranen zweier benachbarter Zellen in begrenzt ist Im Fall von disulfidischen Proteinen in voller Länge würde es diese nur verstärken. Unser Experiment zielte darauf ab, die Hypothese der Fähigkeit des NKR-P1-Rezeptors zu testen, im Kontext der Zellmembran Cluster (vernetzte Oligomere) zu bilden, wenn er die dimere Spezies von LLT1 angreift. Dieser Versuchsaufbau ermöglichte es uns, die Konzentration von LLT1 während der gesamten Messung zu normalisieren und gleichzeitig das Vorhandensein von hauptsächlich dimerem LLT1 in der Lösung sicherzustellen. Darüber hinaus passten unsere SEC-SAXS-Daten am besten zu Multimerketten in abwechselnden primären und sekundären Wechselwirkungsmodi (ergänzende Abbildung 5), obwohl die gesamte Bibliothek aller möglichen Modelle, einschließlich derjenigen, die ausschließlich auf dem primären oder sekundären Modus basieren, enthalten war in der Analyse. Akzeptable χ2-Werte wurden hauptsächlich für Multimermodelle mit alternierender Anordnung erhalten. Zusammenfassend kommen wir zu dem Schluss, dass die Kombination beider Interaktionsmodi für eine biologisch plausible multimere Interaktion notwendig ist, was durch die Ergebnisse des NK-Zell-vermittelten Zytotoxizitätstests weiter gestützt wird (Abb. 7).

Obwohl eine solche funktionelle Multimerisierung von NK-CTLRs größtenteils übersehen wurde, ist die Bildung ähnlicher Nanocluster für die Interaktion zwischen der Immunglobulinfamilie der KIRs und MHC-Klasse-I-Glykoproteinen53 oder die Interaktion zwischen KIR2DL1 und NKG2D54 gut beschrieben. Darüber hinaus wurde in den Kristallstrukturen der co-stimulierenden Immunkomplexe B7-1:CTLA-4 und B7-2:CTLA-455,56 über ein periodisches reißverschlussartiges Netzwerk interagierender Dimere berichtet. Interessanterweise wird B7-1 auf der Zelloberfläche in einem dynamischen Gleichgewicht zwischen Monomeren und nichtkovalenten Dimeren exprimiert. Bei Interaktion mit dem co-stimulierenden Rezeptor CD28 bildet B7-1 ein Interaktionsnetzwerk, das aus B7-1- und CD28-Homodimeren besteht. Die Entkopplung dieser Wechselwirkung wird durch die Dissoziation von B7-1 zu Monomeren erleichtert, wohingegen die Insertion des obligaten B7-1-Dimers zu einer verlängerten, abnormalen Signalübertragung zwischen Antigen-präsentierenden Zellen und T-Zellen führt57.

Obwohl sowohl LLT1 als auch NKR-P1 als Proteine ​​voller Länge kovalente Disulfidhomodimere auf der Zelloberfläche bilden7,36, wurde unseres Wissens nach der dimere Zustand ihrer CTL-Ektodomänen in lebenden Zellen noch nicht untersucht. Umgekehrt wurde die Bildung des Helix-α2-zentrierten nichtkovalenten Homodimers der löslichen LLT1-Ektodomäne bereits zuvor charakterisiert40,43,44 und findet wahrscheinlich auch innerhalb des Proteins voller Länge statt. Das menschliche NKR-P1-Helix-α1-zentrierte Dimer nutzt weniger intermolekulare Kontakte, hat eine kleinere Kontaktoberfläche als Helix-α2-zentrierte dimere CTLRs und ist daher weniger stabil. Dennoch würde seine Bildung im Zusammenhang mit dem Disulfidhomodimer des NKR-P1-Rezeptors in voller Länge voraussichtlich zunehmen. Gleichzeitig verleiht die Länge der NKR-P1-Stielregion (25 Aminosäuren) genügend Flexibilität für das CTLD-Monomer/Dimer-Gleichgewicht innerhalb des Disulfidhomodimers des Volllängenrezeptors selbst, das dann durch Polymorphismus und Glykosylierung weiter reguliert würde Heterogenität an der NKR-P1-Dimerisierungsschnittstelle (Abb. 8c, unten links). Ähnlich wie beim B7-1:CD28-System kann somit ein Gleichgewicht zwischen den Monomer- und Dimerzuständen der CTL-Ektodomänen, das die Fähigkeit von NKR-P1, stabile Komplexe höherer Ordnung mit LLT1 zu bilden, modifiziert und feinabstimmt, die Stärke regulieren und Signalisierung des NKR-P1:LLT1-Systems, während die Vernetzung von NKR-P1 durch LLT1 innerhalb der Immunsynapse für genügend Avidität für eine stabile Signalübertragung durch diesen Interaktionskomplex mit niedriger Affinität sorgen könnte.

Zusammenfassend zeigen die präsentierten Daten, dass die Kristallstruktur des NKR-P1:LLT1-Komplexes einen neuartigen Weg der C-Typ-Lectin-ähnlichen NK-Zellrezeptor-Ligand-Multimerisierung auf der Zelloberfläche darstellt, der erklärt, wie die Ligandenbindung eine niedrige Affinität durch den Rezeptor überwindet Vernetzung innerhalb der Immunsynapse.

Die stabilisierte H176C-Form der löslichen LLT1-Ektodomäne (Gln72-Val191) wurde vorübergehend in HEK293S-GnTI–-Zellen exprimiert, wie zuvor beschrieben44. Die N120R-, R153E- und K169A-Mutante im sekundären Interaktionsmodus LLT1SIM wurde auf die gleiche Weise kloniert und produziert. Die C-Typ-Lectin-ähnliche Domäne von menschlichem NKR-P1 wurde auf ähnliche Weise in stabil transfizierten HEK293S-GnTI–-Zellen produziert50. Kurz gesagt, das Expressionskonstrukt, das der extrazellulären CTL-Domäne von NKR-P1 (Gly90-Ser225) entspricht, wurde in das pOPINGGTneo-Plasmid (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Ray Owens, Universität Oxford) subkloniert, flankiert vom N-terminalen Sekretionsleiter und von der C-terminale His-Tag (mit dem ETG und dem KHHHHHH an den N- bzw. C-Termini des sekretierten Proteins). Eine Suspensionskultur von HEK293S-GnTI–-Zellen58 wurde mit einer 1:3-Mischung (Gew./Gew.) des Expressionsplasmids und linearem 25-kDa-Polyethylenimin transfiziert. Der stabil transfizierte Zellpool wurde innerhalb von drei Wochen mit 200 ng/µl G418 selektiert. Die sekretierten Proteine ​​wurden aus den geernteten Medien durch zweistufige Chromatographie gereinigt – eine IMAC wurde auf einer Talon-Säule (GE Healthcare) durchgeführt, gefolgt von SEC auf einer Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) in 10 mM HEPES pH 7,5 mit 150 mM NaCl und 10 mM NaN3. Für dSTORM-Mikroskopie und In-vitro-NK-Zell-Assays (siehe unten) wurde der Puffer gegen PBS in Gewebekulturqualität (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4) ausgetauscht. Zur Deglykosylierung wurde GST-fusioniertes Endo F159 in einem Gewichtsverhältnis von 1:100 zu Proteinen in SEC-Puffer mit 50 mM Citrat, pH 5,5, gegeben und 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die deglykosylierten Proteine ​​wurden dann durch Batch-Affinitätschromatographie auf Glutathion-Sepharose-4B-Harz (GE Healthcare) und anschließender SEC, wie oben beschrieben, gereinigt.

NKR-P1 glykosyliert (Struktur NKR-P1_glyco) – Lösliche menschliche NKR-P1-Ektodomäne mit 20 mg/ml in SEC-Puffer wurde unter Verwendung der Sitzungstropfen-Dampfdiffusionsmethode kristallisiert. Tropfen (100 nl Reservoirlösung und 100 nl Proteinlösung) wurden mit einem Cartesian Honeybee 961-Roboter (Genomic Solutions) bei 294 K angelegt. Das Reservoir bestand aus 20 % (Gew./Vol.) PEG 3350, 200 mM Dinatrium Tartrat pH 7,2 (PEG/Ionen-Screen, Zustand 36; Hampton Research). Ein hexagonaler Kristall mit Abmessungen von 150 × 150 × 20 µm wurde durch Einweichen in die Reservoirlösung unter Zusatz von 25 % (v/v) Ethylenglykol kryogeschützt.

NKR-P1 deglykosyliert (Struktur NKR-P1_deglyco) – Die Endo F1-deglykosylierte lösliche menschliche NKR-P1-Ektodomäne wurde auf 12 mg/ml konzentriert und wie oben beschrieben kristallisiert. Das Reservoir bestand aus 20 % (Gew./Vol.) PEG 3350, 200 mM Ammoniumfluorid und 200 mM Lithiumchlorid, pH 6,2 (PEG/Ionen-Screening, Bedingung 3, Additiv-Screening, Bedingung 17; Hampton Research). Ein 50 × 50 × 150 µm großer stabförmiger Kristall wurde wie oben durch Zugabe von 25 % (v/v) Glycerin kryogeschützt.

NKR-P1:LLT1-Komplex (Struktur NKR-P1:LLT1) – Die Endo F1-deglykosylierten löslichen menschlichen NKR-P1- und LLT1-Ektodomänen wurden im Molverhältnis 1:1 gemischt und auf eine Gesamtproteinkonzentration von 8 mg/ml konzentriert. Der Proteinkomplex wurde wie oben beschrieben kristallisiert; Tropfen (200 nl des Reservoirs und 100 nl Proteinlösungen) wurden mit 50 nl Stammlösung aus zerkleinerten nadelförmigen Kristallen von deglykosyliertem NKR-P1, gezüchtet in 20 % (w/v) PEG 3350, 200 mM Ammoniumfluorid pH, beimpft 6.2 (PEG/Ionen-Screen, Bedingung 3; Hampton Research). Das Reservoir bestand aus 200 mM Ammoniumsulfat, 20 % (w/v) PEG MME 5000, 100 mM Tris pH 7,5 (Proplex-Screen, Bedingung 1–40; Molekulare Abmessungen). Ein tetragonaler Bipyramidenkristall mit den Abmessungen 30 × 30 × 80 µm wurde wie oben beschrieben durch Zugabe von 25 % (v/v) Glycerin kryogeschützt.

Alle Beugungsdaten wurden an der Diamond Light Source (Harwell, UK) an der Strahllinie I03 mit einer Wellenlänge von 0,97625 Å und einem PILATUS3 6 M-Detektor gesammelt. Der Kristall-Detektor-Abstand wurde auf 340 mm eingestellt, die Belichtungszeit pro Bild betrug 0,02 s, die Oszillationsbreite betrug 0,1° und die Temperatur betrug 100 K. Für jeden Datensatz wurden 7200 Bilder gesammelt. Im Fall des NKR-P1:LLT1-Komplexes wurden letztendlich nur 5000 Bilder für die Datenverarbeitung verwendet. Alle Beugungsbilder wurden mit dem XDS-Paket60 indiziert und integriert, mit AIMLESS61 skaliert und 5 % der zufällig ausgewählten Reflexionen wurden als Rfree-Satz verwendet. Das Phasenproblem wurde durch molekularen Ersatz gelöst – NKR-P1_glyco: im Programm BALBES62 unter Verwendung der Struktur des menschlichen NK-Zellrezeptors KLRG1, gebunden an E-Cadherin (https://doi.org/10.2210/pdb3FF7/pdb)63; NKR-P1_deglyco: 6 in PHASER64 gefundene Ketten unter Verwendung von murinem NKR-P1A (https://doi.org/10.2210/pdb3T3A/pdb)65 wurden mit 2 in MOLREP66 gefundenen Ketten vervollständigt; NKR-P1:LLT1: 4 Ketten, die in BALBES als NKR-P1-Ketten gefunden wurden (unter Verwendung der Struktur von murinem Dectin-1, https://doi.org/10.2210/pdb2BPD/pdb)48 wurden mit zwei weiteren Ketten in MOLREP vervollständigt, und alle 6 Ketten wurden manuell als 4 NKR-P1-Ketten und als 2 LLT1-Ketten neu interpretiert. Die Verfeinerung wurde mit REFMAC567 und manueller Bearbeitung in COOT68 durchgeführt. Der letzte Verfeinerungszyklus wurde unter Verwendung aller Reflexionen abgeschlossen. Die endgültigen Datenverarbeitungs- und Strukturparameter sind in Tabelle 1 aufgeführt.

NKR-P1_glyco – Die Struktur, die ein Dimer des glykosylierten menschlichen NKR-P1 CTLD umfasst, ist in der Elektronendichtekarte insgesamt gut definiert, was der hohen Auflösung der Struktur (1,8 Å) entspricht. Die Glykosylierung an der Dimerisierungsschnittstelle zeigt nicht die überlappenden Merkmale, die in den Strukturen von deglykosyliertem NKR-P1 (unten) beobachtet werden. GlcNAc wurde auf Asn116 mit vollständiger Besetzung in beiden Ketten modelliert, wohingegen in der Elektronendichtekarte keine Glykosylierung an Asn157 beobachtet wurde. Alle modellierten Glykosylierungsketten (GlcNAc2Man5 an A/Asn169, GlcNAc2Man3 an B/Asn169 und GlcNAc an den Resten Asn116 in beiden Ketten) sind in der Elektronendichtekarte gut lokalisiert.

NKR-P1_deglyco – Die asymmetrische Einheit besteht aus vier Dimeren des menschlichen NKR-P1 CTLD, die nach der ersten GlcNAc-Einheit deglykosyliert wurden. Die Länge des lokalisierten Teils der Proteinkette variiert von den kürzesten Ketten A, F und G mit den modellierten Resten Leu91–Leu214 bis zur längsten Kette H mit den Resten Gly90–Arg218. GlcNAc am Rest Asn169 ist gut lokalisiert, während an Asn116 und Asn157 an der Dimerisierungsschnittstelle gebundene GlcNAc-Einheiten in alternativen und überlappenden Positionen vorhanden sind; Rest Asn116 zeigt auch alternative Konformere. An Asn157 und Asn116 gebundene GlcNAc-Einheiten wurden mit 0,5 Besetzungen modelliert, und nur die deutlichsten Einheiten aus jedem überlappenden Paar wurden modelliert (Tabelle 1).

NKR-P1:LLT1 – Die asymmetrische Einheit enthält zwei Dimere des menschlichen NKR-P1 CTLD und ein Dimer des LLT1 CTLD. Die Struktur verfügt über eine wohldefinierte Elektronendichtekarte und alle Proteinketten können eindeutig zugeordnet werden. Die deutlichsten Differenzpeaks entsprechen nicht interpretierbaren kleinen Liganden. LLT1 verfügt über gut lokalisierte GlcNAc-Einheiten an den Resten Asn95 und Asn147. Lokalisierte GlcNAc-Einheiten von NKR-P1 sind die gleichen wie diejenigen, die in der NKR-P1_deglyco-Struktur identifiziert wurden (vorheriger Absatz).

Zirkulardichroismus-Spektren (CD) von Wildtyp und S159A NKR-P1 sowie Wildtyp und SIM LLT1 wurden mit einem Chirascan Plus CD-Spektropolarimeter mit Pro-Data Chirascan-Software (Applied Photophysics) und einer Quarzzelle mit 0,1 cm Weglänge aufgezeichnet. Spektren wurden über den Wellenlängenbereich von 195–260 nm in Schritten von 1 nm bei Raumtemperatur aufgenommen. Die Probenkonzentrationen betrugen 0,2 mg/ml bzw. 0,3 mg/ml für NKR-P1- und LLT1-Proteinproben in 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5-Probenpuffer. Das CD-Signal wurde als Elliptizität ausgedrückt und die resultierenden Spektren wurden vom Puffer abgezogen. Die Zusammensetzung der Sekundärstruktur wurde mit der Software CDNN 2.1 (Applied Photophysics) analysiert.

Die Bildung des NKR-P1:LLT1-Komplexes und die Dimerisierung der NKR-P1-S159A-Mutante wurden in einer analytischen Ultrazentrifuge ProteomeLab XL-I (Beckman Coulter)69 analysiert. Für das Sedimentationsgeschwindigkeitsexperiment wurden Proben von glykosyliertem NKR-P1, LLT1 und ihren äquimolaren Gemischen mit steigenden Konzentrationen in SEC-Puffer im An-50 Ti-Rotor (Beckman Coulter) bei 48.000 U/min bei 20 °C und 150 Scans mit gedreht Mithilfe einer Absorptionsoptik wurde eine räumliche Auflösung von 0,003 cm in 5-Minuten-Schritten aufgezeichnet. Die Zentrifuge wurde mit der ProteomeLab-Software (Beckman Coulter) betrieben. Die Pufferdichte und die partiellen spezifischen Proteinvolumina wurden in SEDNTERP (http://www.jphilo.mailway.com) geschätzt. Die Daten wurden mit SEDFIT70 unter Verwendung des kontinuierlichen c(s)-Verteilungsmodells analysiert. Bindungsisothermen (und Abbildungen zur Veranschaulichung der AUC-Daten) wurden in GUSSI71 erstellt und dann in SEDPHAT72 unter Verwendung der Heteroassoziationsmodelle A + B ⇔ AB oder A + B ⇔ AB + B ⇔ ABB am besten angepasst, wobei A das LLT1-Dimer und B ist NKR-P1-Monomer. In der Anpassung wurden nur KD- und Sedimentationskoeffizienten von AB oder ABB berücksichtigt. die anderen Parameter wurden auf bekannten Werten konstant gehalten.

Für die mikroskaligen Thermophorese (MST)-Messungen der NKR-P1:LLT1- und NKR-P1:LLT1SIM-Wechselwirkungen wurde NKR-P1 mit Atto 488 NHS-Ester (Merck) bei pH 6,5 fluoreszierend markiert; Die überschüssige Markierung wurde durch Größenausschlusschromatographie entfernt. Fluoreszenzmarkiertes 100 nM NKR-P1 wurde mit Verdünnungsreihen von LLT1 oder LLT1SIM gemischt und in Standardkapillaren in einem NT.115-Monolithen unter Verwendung der MO.Control-Software (NanoTemper), 30 % LED-Anregungsleistung und 60 % MST-Leistung analysiert. Rohdaten wurden in PALMIST73 analysiert; Die exportierten Isothermen wurden am besten in SEDPHAT72 angepasst und die Zahlen in GUSSI71 erstellt.

SEC-SAXS-Daten für den NKR-P1:LLT1-Komplex wurden an der Diamond Light Source (Didcot, UK) an Strahllinie 21 mit einem Agilent 1200 HPLC-System mit 2,4 ml Superdex 200-Säule (GE Healthcare) und einem Pilatus P3-2M-Detektor gesammelt , 12,4 keV Strahlung und 4,014 m Abstand zwischen Probe und Detektor. Die menschlichen NKR-P1- und LLT1-Ektodomänen mit GlcNAc2Man5-Glykanen, verdünnt in 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 10 mM NaN3, pH 7,5, wurden in einem Molverhältnis von 1:1 gemischt. Die Daten wurden bei 293 K für Puffer- und Proteinproben mit einer Beladungskonzentration von 15 mg/ml gesammelt. Die Daten in ausgewählten Intervallen (Frames 355–367, 368–378, 379–388, 388–399, 431–440, 481–491) wurden in SCÅTTER (entwickelt von Robert Rambo an der Diamond Light Source, https: //www.bioisis.net/tutorials/9) und dann in den Intervallen separat zusammengeführt und mit dem ATSAS74-Paket charakterisiert. Als Beweis für die Datenqualität sind in Abb. 5 das Streudiagramm, das Kratky-Diagramm und die Paarabstandsverteilungsfunktion P(r) für die Intervalle 389–399 (ein Beispieldatenbereich vom ersten Peak) und 481–491 (a) dargestellt Beispieldatenbereich ab dem zweiten Peak). Die Streuungs- und Guinier-Diagramme für alle Datenbereiche sind in der ergänzenden Abbildung 5 dargestellt. Die Übereinstimmung zwischen den SAXS-Daten und unserer 3D-Kristallstruktur des NKR-P1:LLT1-Komplexes wurde mit OLIGOMER75 bewertet. Eine Bibliothek von NKR-P1- und LLT1-Strukturmodellen, die Monomere, Dimere und ihre interagierenden Multimere in verschiedenen Permutationen primärer und sekundärer Interaktionsmodi darstellen, wurde in PyMOL aus den hier gelösten Kristallstrukturen durch Anwendung von Symmetrieoperationen generiert (insgesamt 49 verschiedene Modelle). Dem OLIGOMER-Algorithmus wurde dann die Auswahl ihrer Kombinationen überlassen, um alle einzelnen Streukurven und Kurven, die sich aus den sechs ausgewählten zusammengeführten Datenintervallen ergeben (Ergänzungsdaten 1 und Ergänzungsabbildung 5), am besten anzupassen.

Stabile NKR-P1-Transfektanten voller Länge wurden in der HEK293S-GnTI–-Zelllinie unter Verwendung des piggyBac-Transposon-basierten Systems mit Doxycyclin-induzierbarer Proteinexpression erzeugt76. Mikroskopische Proben wurden aus Zellen hergestellt, die über Nacht mit 5 ng/ml Doxycyclin behandelt wurden. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und 1 Stunde bei 37 °C mit 8,4 mg/ml LLT1 oder LLT1SIM in PBS oder PBS allein inkubiert. Nach der Inkubation ließ man die Zellen 25 Minuten lang bei 37 °C auf der Oberfläche von PLL-beschichteten Glasobjektträgern absetzen. Anschließend wurden die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 % PFA und 0,2 % GA fixiert und dreimal mit PBS gewaschen. Zur Antikörperfärbung wurden die Zellen zunächst 30 Minuten lang mit 5 % BSA blockiert und dann 60 Minuten lang mit Alexa Fluor® 647 Anti-Human-CD161-Antikörper (Klon HP-3G10; BioLegend) bei 10 µg/ml in Blockierungslösung gefärbt. Die Proben wurden fünfmal mit PBS gewaschen, bevor sie 10 Minuten lang mit 4 % PFA und 0,2 % GA nachfixiert wurden. Abschließend wurden die Zellen mit 15 mM NH4Cl behandelt und zweimal mit PBS gewaschen. dSTORM-Bilder wurden mit Elyra PS.1 unter Verwendung der Zen Black Edition-Software (Carl Zeiss) aufgenommen. Referenzmarker (FluoSpheres F8801; Thermo Fisher) wurden in PBS verdünnt und 1 Stunde lang auf der Probe absetzen gelassen (die Endverdünnung des Perlenstamms betrug 100.000 ×). Vor jeder Messung wurde der Puffer gegen Glucoseoxidase/Katalase/MEA-basierten Bildgebungspuffer ausgetauscht und die Probe mit Deckglas und Silikon versiegelt, um eine Pufferoxidation zu verhindern. Für jede Zelle wurden 2 × 104 Rohbilder im HP TIRF-Beleuchtungsmodus mit einer Belichtungszeit von 15 ms unter Verwendung von 100 % der 642-nm-Laserleistung und einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,46 aufgenommen. Wir haben die gleiche Charge und Konzentration des Antikörpers verwendet, um eine konsistente Markierung innerhalb der einzelnen Messungen für alle Experimente sicherzustellen. Darüber hinaus haben wir in jeder einzelnen Messreihe immer Bedingungen mit und ohne löslichen Liganden gemessen, um eine konsistente Gesamtdatenqualität über die gesamte Studie hinweg sicherzustellen.

Hochauflösende dSTORM-Bilder wurden aus Rohbildsequenzen mit dem ThunderSTORM-Plug-in77 für die ImageJ-Verarbeitungssoftware78 rekonstruiert. Die Subpixel-Lokalisierung von Molekülen wurde durch Anpassen eines integrierten Gaußschen Punktverteilungsfunktionsmodells unter Verwendung der Maximum-Likelihood-Schätzungsanpassungsmethode79 durchgeführt. Rekonstruierte dSTORM-Bilder wurden mithilfe von Referenzmarkierungen auf Drift und auf mehrere Lokalisierungen aus einer einzigen Quelle korrigiert, indem Ereignisse innerhalb von 20 nm, die in aufeinanderfolgenden Bildern auftraten, zusammengeführt wurden (mit einem Off-Gap von 5 Bildern). Die Voronoi-Tessellationsclusteranalyse wurde in ClusterViSu80 auf der gesamten inneren Zelloberfläche durchgeführt (Zellränder und andere konzentrierte Membranregionen wurden von der Analyse ausgeschlossen). Ein Schwellenwert von 250 wurde gewählt, indem die Verteilung der Voronoi-Polygonoberflächenwerte zwischen Lokalisierungen in den Versuchsgebieten und randomisierten Regionen mit derselben Ereignisdichte verglichen wurde. Cluster mit weniger als zwei Fluoreszenzereignissen wurden aus dem Datensatz verworfen. Mehrere Mittelwerte wurden mit einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) mit Bonferroni-Korrektur in OriginPro 2018 verglichen. Diagramme zeigen Mittelwerte und Fehlerbalken stellen die SD dar. Werte von p > 0,05 werden als nicht signifikant angezeigt; Statistisch signifikante p-Werte werden mit Sternchen (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001) gekennzeichnet.

Der Einfluss von LLT1 oder LLT1SIM auf die Hemmung der zytotoxischen Aktivität primärer NK-Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie bewertet. Buffy Coats für die Isolierung menschlicher NK-Zellen wurden vom Institut für Hämatologie und Bluttransfusion (IHBT, Prag, Tschechische Republik) als Material für Forschungszwecke erworben. Das IHBT hat das Einverständnis der Spender eingeholt. Primäre NK-Zellen wurden durch negative Selektion unter Verwendung eines NK-Zell-Isolierungskits (Miltenyi Biotec) gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. Gereinigte NK-Zellen wurden über Nacht mit 1 × 106 Zellen/ml in RPMI 1640, ergänzt mit 10 % FCS, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 80 ng/ml IL-2 (Sigma-Aldrich), zu ihrer Aktivierung kultiviert . K562-Zielzellen wurden mit dem CellTrace Violet Proliferation Kit (Thermo Fisher) gefärbt. Nach der Färbung wurden 1 × 104 Zielzellen mit aktivierten NK-Zellen im Verhältnis 40:1 (E:T) gemischt und LLT1- oder LLT1SIM-Proteine ​​hinzugefügt, wobei das endgültige Reaktionsvolumen bei 20 μl (6,5 μl K562 und 6,5 μl) gehalten wurde µl NK-Zellsuspensionen und 7 µl der konzentrierten Proteinstammlösungen in PBS, bis zu einer Endproteinkonzentration von 50 oder 250 µM. Nach 4-stündiger Inkubation wurde die Zellmischung bei 300 × g zentrifugiert und mit 1 μg/ml 7-AAD angefärbt. Die Zellen wurden mit einem BD LSR II-Durchflusszytometer und der BD FACSDiva-Software (BD Biosciences) in drei unabhängigen Zytotoxizitätstests analysiert, die unter Verwendung von NK-Zellen von drei verschiedenen gesunden Spendern in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Die Daten wurden in der FlowJo-Software (BD Biosciences) analysiert. Die Gating-Strategie für die Durchflusszytometrie-Analyse ist in der ergänzenden Abbildung 7 dargestellt. Die Daten werden als Mittelwert der Messungen mit SD dargestellt. Gegebenenfalls wurden die Daten durch eine einfache ANOVA statistisch ausgewertet, wobei Werte von p <0,05 als statistisch signifikant angesehen wurden.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die verfeinerten Koordinaten- und Strukturfaktordateien für die in dieser Studie berichteten Röntgenkristallstrukturen wurden von der Proteindatenbank (https://www.wwpdb.org) validiert und dort unter den Zugangsnummern von https://doi hinterlegt .org/10.2210/pdb5MGR/pdb (NKR-P1_glyco), https://doi.org/10.2210/pdb5MGS/pdb (NKR-P1_deglyco) und https://doi.org/10.2210/pdb5MGT/pdb (NKR- P1:LLT1). Links zu den anderen PDB-Einträgen in diesem Dokument sind https://doi.org/10.2210/pdb2BPD/pdb, https://doi.org/10.2210/pdb2CL8/pdb, https://doi.org/10.2210/pdb3FF7/ pdb, https://doi.org/10.2210/pdb3T3A/pdb, https://doi.org/10.2210/pdb4IOP/pdb, https://doi.org/10.2210/pdb4QKI/pdb, https://doi. org/10.2210/pdb5J2S/pdb und https://doi.org/10.2210/pdb6E7D/pdb. Beugungsdaten wurden in der SBGrid-Datenbank unter den Codes 778 (NKR-P1_glyco; https://doi.org/10.15785/SBGRID/778) hinterlegt; 779 (NKR-P1_deglyco, https://doi.org/10.15785/SBGRID/779) und 780 (NKR-P1:LLT1; https://doi.org/10.15785/SBGRID/780). Beugungsdaten aus dem SEC-SAXS-Experiment wurden bei Mendeley Data (https://doi.org/10.17632/268ww2m4j31)81 hinterlegt. Die Gesamtausgabe der OLIGOMER-Analyse der SEC-SAXS-Daten ist als Ergänzungsdaten 1 verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Vivier, E. et al. Angeborene oder adaptive Immunität? Das Beispiel natürlicher Killerzellen. Wissenschaft 331, 44–49 (2011).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cerwenka, A. & Lanier, LL Natürliches Killerzellgedächtnis bei Infektionen, Entzündungen und Krebs. Nat. Rev. Immunol. 16, 112–123 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yokoyama, WM & Plougastel, BF Immunfunktionen, die durch den natürlichen Killergenkomplex kodiert werden. Nat. Rev. Immunol. 3, 304–316 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bartel, Y., Bauer, B. & Steinle, A. Modulation der NK-Zellfunktion durch genetisch gekoppelte C-Typ-Lektin-ähnliche Rezeptor/Liganden-Paare, die im menschlichen natürlichen Killergenkomplex kodiert sind. Vorderseite. Immunol. 4, 362 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Zelensky, AN & Gready, JE Die C-Typ-Lektin-ähnliche Domänen-Superfamilie. FEBS J. 272, 6179–6217 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rozbesky, D. et al. Neubewertung der Bindungseigenschaften der rekombinanten Lymphozytenrezeptoren NKR-P1A und CD69 an chemisch synthetisierte Glykane und Peptide. Int. J. Mol. Wissenschaft. 15, 1271–1283 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Lanier, LL, Chang, C. & Phillips, JH Menschliches NKR-P1A. Ein Disulfid-verknüpftes Homodimer der C-Typ-Lectin-Superfamilie, das von einer Untergruppe von NK- und T-Lymphozyten exprimiert wird. J. Immunol. 153, 2417–2428 (1994).

CAS PubMed Google Scholar

Spreu, J. et al. Die Interaktion der C-Typ-Lektin-ähnlichen Rezeptoren NKp65 und KACL erleichtert die gezielte Immunerkennung menschlicher Keratinozyten. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 107, 5100–5105 (2010).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Welte, S., Kuttruff, S., Waldhauer, I. & Steinle, A. Gegenseitige Aktivierung natürlicher Killerzellen und Monozyten, vermittelt durch NKp80-AICL-Interaktion. Nat. Immunol. 7, 1334–1342 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Vogler, I. & Steinle, A. Vis-a-vis im NKC: genetisch verknüpfte Rezeptor/Liganden-Paare natürlicher Killerzellen im natürlichen Killer-Gen-Komplex (NKC). J. Angeborenes Immunsystem. 3, 227–235 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Aldemir, H. et al. Auf dem neuesten Stand: Das Lektin-ähnliche Transkript 1 ist ein Ligand für den CD161-Rezeptor. J. Immunol. 175, 7791–7795 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rosen, DB et al. Auf dem neuesten Stand: Lektin-ähnliches Transkript-1 ist ein Ligand für den inhibitorischen menschlichen NKR-P1A-Rezeptor. J. Immunol. 175, 7796–7799 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Poggi, A., Costa, P., Tomasello, E. & Moretta, L. IL-12-induzierte Hochregulierung der NKRP1A-Expression in menschlichen NK-Zellen und daraus resultierende NKRP1A-vermittelte Herunterregulierung der NK-Zellaktivierung. EUR. J. Immunol. 28, 1611–1616 (1998).

3.0.CO;2-6" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291521-4141%28199805%2928%3A05%3C1611%3A%3AAID-IMMU1611%3E3.0.CO%3B2-6" aria-label="Article reference 13" data-doi="10.1002/(SICI)1521-4141(199805)28:053.0.CO;2-6">Artikel CAS PubMed Google Scholar

Exley, M., Porcelli, S., Furman, M., Garcia, J. & Balk, S. CD161 (NKR-P1A) Kostimulation der CD1d-abhängigen Aktivierung menschlicher T-Zellen, die den invarianten V-Alpha-24-J-Alpha-QT-Zellrezeptor exprimieren Alpha-Ketten. J. Exp. Med. 188, 867–876 (1998).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ussher, JE et al. CD161++ CD8+ T-Zellen, einschließlich der MAIT-Zelluntergruppe, werden durch IL-12+IL-18 auf TCR-unabhängige Weise spezifisch aktiviert. EUR. J. Immunol. 44, 195–203 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fergusson, JR et al. CD161 definiert einen transkriptionellen und funktionellen Phänotyp über verschiedene menschliche T-Zelllinien hinweg. Cell Rep. 9, 1075–1088 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Germain, C. et al. Die Induktion der Zelloberflächenexpression des Lektin-ähnlichen Transkript-1-Proteins (LLT1) durch Krankheitserreger und Interferon-Gamma trägt zur Modulation von Immunantworten bei. J. Biol. Chem. 286, 37964–37975 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bennett, IM et al. Definition einer natürlichen Killer-NKR-P1A+/CD56-/CD16- funktionell unreifen Untergruppe menschlicher NK-Zellen, die in vitro in Gegenwart von Interleukin 12 differenziert. J. Exp. Med. 184, 1845–1856 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cosmi, L. et al. Menschliche Interleukin-17-produzierende Zellen stammen aus einem CD161+CD4+-T-Zellvorläufer. J. Exp. Med. 205, 1903–1916 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mathewson, ND et al. In Gliom-infiltrierenden T-Zellen durch Einzelzellanalyse identifizierter inhibitorischer CD161-Rezeptor. Zelle 184, 1281–1298 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Poggi, A., Costa, P., Zocchi, MR & Moretta, L. Phänotypische und funktionelle Analyse von CD4+ NKRP1A+ menschlichen T-Lymphozyten. Direkter Beweis dafür, dass das NKRP1A-Molekül an der transendothelialen Migration beteiligt ist. EUR. J. Immunol. 27, 2345–2350 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chalan, P. et al. Expression von Lektin-ähnlichem Transkript 1, dem Liganden für CD161, bei rheumatoider Arthritis. PLoS One 10, e0132436 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Rosen, DB et al. Funktionelle Konsequenzen von Wechselwirkungen zwischen menschlichem NKR-P1A und seinem Liganden LLT1, der auf aktivierten dendritischen Zellen und B-Zellen exprimiert wird. J. Immunol. 180, 6508–6517 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Boles, KS, Barten, R., Kumaresan, PR, Trowsdale, J. & Mathew, PA Klonierung eines neuartigen Lektin-ähnlichen Rezeptors, der auf menschlichen NK-Zellen exprimiert wird. Immungenetik 50, 1–7.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Roth, P. et al. Maligne Gliomzellen wirken antitumoralen Immunantworten durch die Expression von Lektin-ähnlichem Transkript-1 entgegen. Krebs Res. 67, 3540–3544 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mathew, SO, Chaudhary, P., Powers, SB, Vishwanatha, JK & Mathew, PA Die Überexpression von LLT1 (OCIL, CLEC2D) auf Prostatakrebszellen hemmt die durch LLT1-NKRP1A (CD161)-Wechselwirkung vermittelte Abtötung von NK-Zellen. Oncotarget 7, 68650–68661 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Marrufo, AM et al. Die Blockierung der LLT1 (CLEC2D, OCIL)-NKRP1A (CD161)-Interaktion verstärkt die durch natürliche Killerzellen vermittelte Lyse von dreifach negativen Brustkrebszellen. Bin. J. Cancer Res. 8, 1050–1063 (2018).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Germain, C. et al. Das Lektin-ähnliche Transkript 1 ist ein Marker für aus dem Keimzentrum stammende B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphome, die die Funktionen natürlicher Killerzellen dämpfen. Oncoimmunology 4, e1026503 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Zambrano-Zaragoza, JF, Romo-Martinez, EJ, Duran-Avelar Mde, J., Garcia-Magallanes, N. & Vibanco-Perez, N. Th17-Zellen bei Autoimmun- und Infektionskrankheiten. Int. J. Inflam. 2014, 651503 (2014).

PubMed PubMed Central Google Scholar

Afzali, B. et al. Die CD161-Expression charakterisiert eine Subpopulation menschlicher regulatorischer T-Zellen, die IL-17 in STAT3-abhängiger Weise produziert. EUR. J. Immunol. 43, 2043–2054 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Billerbeck, E. et al. Die Analyse der CD161-Expression auf menschlichen CD8+-T-Zellen definiert eine bestimmte funktionelle Untergruppe mit Gewebe-Homing-Eigenschaften. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 107, 3006–3011 (2010).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Smith, JA & Colbert, RA Review: Die Interleukin-23/Interleukin-17-Achse in der Pathogenese der Spondyloarthritis: Th17 und darüber hinaus. Arthritis Rheumatol. 66, 231–241 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brucklacher-Waldert, V., Stuerner, K., Kolster, M., Wolthausen, J. & Tolosa, E. Phänotypische und funktionelle Charakterisierung von T-Helfer-17-Zellen bei Multipler Sklerose. Brain 132, 3329–3341 (2009).

Artikel PubMed Google Scholar

Estrada-Capetillo, L. et al. Induktion von Th17-Lymphozyten und Treg-Zellen durch von Monozyten abgeleitete dendritische Zellen bei Patienten mit rheumatoider Arthritis und systemischem Lupus erythematodes. Klin. Entwickler Immunol. 2013, 584303 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Michalak-Stoma, A. et al. Serumspiegel ausgewählter Th17- und Th22-Zytokine bei Psoriasis-Patienten. Dis. Marker 35, 625–631 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Germain, C. et al. Charakterisierung alternativ gespleißter Transkriptvarianten des CLEC2D-Gens. J. Biol. Chem. 285, 36207–36215 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, Y., Wang, Q., Chen, S., Brown, PH & Mariuzza, RA Die Struktur von NKp65, gebunden an seinen Keratinozyten-Liganden, enthüllt die Grundlage für die genetisch verknüpfte Erkennung im natürlichen Killergenkomplex. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 110, 11505–11510 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bauer, B., Spreu, J., Rohe, C., Vogler, I. & Steinle, A. Schlüsselreste an der membrandistalen Oberfläche von KACL, aber nicht die Glykosylierung, bestimmen die funktionelle Interaktion des Keratinozyten-spezifischen C- Typ Lektin-ähnlicher Rezeptor KACL mit seinem hochaffinen Rezeptor NKp65. Immunologie 145, 114–123 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kamishikiryo, J., Fukuhara, H., Okabe, Y., Kuroki, K. & Maenaka, K. Molekulare Basis für die LLT1-Proteinerkennung durch menschliches CD161-Protein (NKRP1A/KLRB1). J. Biol. Chem. 286, 23823–23830 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kita, S. et al. Kristallstruktur der extrazellulären Domäne des menschlichen Lektin-ähnlichen Transkripts 1 (LLT1), dem Liganden für den natürlichen Killerrezeptor P1A. EUR. J. Immunol. 45, 1605–1613 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Aguilar, OA et al. Ein virales Immunevasin kontrolliert die angeborene Immunität, indem es auf den prototypischen natürlichen Killer abzielt. Zellrezeptor-Fam. Zelle 169, 58–71 (2017).

CAS Google Scholar

Balaji, GR et al. Die Erkennung des Wirts-Clr-b durch den inhibitorischen NKR-P1B-Rezeptor bietet eine Grundlage für die Erkennung des fehlenden Selbst. Nat. Komm. 9, 4623 (2018).

Artikel ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Skalova, T. et al. Vier Kristallstrukturen von menschlichem LLT1, einem Liganden von menschlichem NKR-P1, in verschiedenen Glykosylierungs- und Oligomerisierungszuständen. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 71, 578–591 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blaha, J., Pachl, P., Novak, P. & Vanek, O. Expression und Reinigung der löslichen und stabilen Ektodomäne des natürlichen Killerzellrezeptors LLT1 durch hochdichte Transfektion von Suspensions-adaptierten HEK293S GnTI(-)-Zellen. Prot. Ausdruck Purif. 109, 7–13 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Vanek, O. et al. Lösliche rekombinante CD69-Rezeptoren, die für eine außergewöhnliche physikalische und chemische Stabilität optimiert sind, zeigen eine längere Zirkulation und bleiben im Blut von Mäusen intakt. FEBS J. 275, 5589–5606 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kolenko, P. et al. Die hochauflösende Struktur der extrazellulären Domäne von menschlichem CD69 unter Verwendung eines neuartigen Polymers. Acta Crystallogr. Sekte. F. Struktur. Biol. Kristall. Komm. 65, 1258–1260 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Skalova, T. et al. Maus-Clr-g, ein Ligand für den NK-Zellaktivierungsrezeptor NKR-P1F: Kristallstruktur und biophysikalische Eigenschaften. J. Immunol. 189, 4881–4889 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Brown, J. et al. Struktur des pilzlichen Beta-Glucan-bindenden Immunrezeptors Dectin-1: Auswirkungen auf die Funktion. Proteinwissenschaft. 16, 1042–1052 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vanek, O. et al. Produktion rekombinanter löslicher dimerer C-Typ-Lectin-ähnlicher Rezeptoren natürlicher Killerzellen der Ratte. Wissenschaft. Rep. 9, 17836 (2019).

Artikel ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Blaha, J. et al. Hochgradige Expression und Reinigung der löslichen Form des menschlichen natürlichen Killerzellrezeptors NKR-P1 in HEK293S-GnTI-Zellen. Proteinexpr. Purif. 140, 36–43 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rother, S. et al. Der c.503T>C-Polymorphismus im menschlichen KLRB1-Gen verändert die Ligandenbindung und das Hemmpotenzial von CD161-Molekülen. PLoS One 10, e0135682 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Skorepa, O. et al. Die Oligomerisierung des natürlichen Killerzellaktivierungsrezeptors NKp30 hängt von seiner N-Glykosylierung ab. Krebserkrankungen 12, 1998 (2020).

Artikel CAS PubMed Central Google Scholar

Davis, DM et al. Die Immunsynapse der natürlichen Killerzelle des Menschen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 96, 15062–15067 (1999).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pageon, SV et al. Hochauflösende Mikroskopie zeigt eine Reorganisation hemmender natürlicher Killerzellrezeptoren im Nanometerbereich bei Aktivierung von NKG2D. Wissenschaft. Signal. 6, ra62 (2013).

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Stamper, CC et al. Kristallstruktur des B7-1/CTLA-4-Komplexes, der menschliche Immunantworten hemmt. Natur 410, 608–611 (2001).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Schwartz, JC, Zhang, X., Fedorov, AA, Nathenson, SG & Almo, SC Strukturelle Grundlage für die Kostimulation durch den menschlichen CTLA-4/B7-2-Komplex. Natur 410, 604–608 (2001).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Bhatia, S., Sun, K., Almo, SC, Nathenson, SG & Hodes, RJ Das dynamische Gleichgewicht von B7-1-Dimeren und -Monomeren wirkt sich unterschiedlich auf die immunologische Synapsenbildung und die T-Zell-Aktivierung als Reaktion auf die TCR/CD28-Stimulation aus. J. Immunol. 184, 1821–1828 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Reeves, PJ, Callewaert, N., Contreras, R. & Khorana, HG Struktur und Funktion in Rhodopsin: hochgradige Expression von Rhodopsin mit eingeschränkter und homogener N-Glykosylierung durch ein Tetracyclin-induzierbares N-Acetylglucosaminyltransferase I-negatives HEK293S-stabiles Säugetier Zelllinie. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 99, 13419–13424 (2002).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Grueninger-Leich, F., D'Arcy, A., D'Arcy, B. & Chene, C. Deglykosylierung von Proteinen zur Kristallisation unter Verwendung rekombinanter Fusionsproteinglycosidasen. Proteinwissenschaft. 5, 2617–2622 (1996).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kabsch, W. Xds. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 66, 125–132 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Evans, PR & Murshudov, GN Wie gut sind meine Daten und wie hoch ist die Auflösung? Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 69, 1204–1214 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Long, F., Vagin, AA, Young, P. & Murshudov, GN BALBES: eine molekulare Ersatzpipeline. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 64, 125–132 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, Y. et al. Die Struktur des an E-Cadherin gebundenen natürlichen Killerzellrezeptors KLRG1 enthüllt die Grundlage für die MHC-unabhängige fehlende Selbsterkennung. Immunität 31, 35–46 (2009).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

McCoy, AJ et al. Phaser-Kristallographiesoftware. J. Appl. Kristalllogr. 40, 658–674 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kolenko, P. et al. Molekulare Architektur von Maus-aktivierenden NKR-P1-Rezeptoren. J. Struktur. Biol. 175, 434–441 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Vagin, A. & Teplyakov, A. Molekularer Ersatz mit MOLREP. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 66, 22–25 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Murshudov, GN et al. REFMAC5 zur Verfeinerung makromolekularer Kristallstrukturen. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 67, 355–367 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Emsley, P., Lohkamp, ​​B., Scott, WG & Cowtan, K. Merkmale und Entwicklung von Blässhuhn. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 66, 486–501 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rozbesky, D. et al. Hochgradige Expression der löslichen Form des natürlichen Killerzellrezeptors NKR-P1C(B6) der Maus in Escherichia coli. Prot. Ausdruck Purif. Rev. 77, 178–184 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Schuck, P. Größenverteilungsanalyse von Makromolekülen durch Sedimentationsgeschwindigkeits-Ultrazentrifugation und Lamm-Gleichungsmodellierung. Biophys. J. 78, 1606–1619 (2000).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brautigam, CA Berechnungen und Illustrationen in Publikationsqualität für analytische Ultrazentrifugationsdaten. Meth. Enzymol. 562, 109–133 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Schuck, P. Zur Analyse der Proteinselbstassoziation durch Sedimentationsgeschwindigkeitsanalytische Ultrazentrifugation. Anal. Biochem. 320, 104–124 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Scheuermann, TH, Padrick, SB, Gardner, KH & Brautigam, CA Zur Erfassung und Analyse mikroskaliger Thermophoresedaten. Anal. Biochem. 496, 79–93 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Petoukhov, MV et al. Neue Entwicklungen im Programmpaket zur Kleinwinkelstreudatenanalyse. J. Appl. Kristalllogr. 45, 342–350 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Konarev, PV, Volkov, VV, Skolova, AV, Koch, MHJ & Svergun, DI PRIMUS: ein Windows-PC-basiertes System für die Analyse von Kleinwinkelstreuungsdaten. J. Appl. Kristalllogr. 36, 1277–1282 (2003).

Artikel CAS Google Scholar

Li, Z., Michael, IP, Zhou, D., Nagy, A. & Rini, JM Einfaches piggyBac-Transposon-basiertes Expressionssystem für Säugetierzellen für die induzierbare Proteinproduktion. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 110, 5004–5009 (2013).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z. & Hagen, GM ThunderSTORM: ein umfassendes ImageJ-Plug-in für PALM- und STORM-Datenanalyse und hochauflösende Bildgebung. Bioinformatik 30, 2389–2390 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schneider, CA, Rasband, WS & Eliceiri, KW NIH Image to ImageJ: 25 Jahre Bildanalyse. Nat. Methoden 9, 671–675 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thompson, RE, Larson, DR & Webb, WW Präzise Nanometer-Lokalisierungsanalyse für einzelne Fluoreszenzsonden. Biophys. J. 82, 2775–2783 (2002).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Andronov, L., Orlov, I., Lutz, Y., Vonesch, JL & Klaholz, BP ClusterViSu, eine Methode zur Clusterung von Proteinkomplexen durch Voronoi-Tessellation in der hochauflösenden Mikroskopie. Wissenschaft. Rep. 6, 24084 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blaha, J., et al. Humane NKR-P1:LLT1 SEC-SAXS-Rohdaten. Mendeley Data, V1, https://data.mendeley.com/datasets/268ww2m4j3/1 (2022).

Lovell, SC et al. Strukturvalidierung durch Calpha-Geometrie: Phi-, Psi- und Cbeta-Abweichung. Proteins 50, 437–450 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Madeira, F. et al. Such- und Sequenzanalyse-Tools-Dienste von EMBL-EBI im Jahr 2022. Nucleic Acids Res. 50, W276–W279 (2022).

Artikel PubMed Central Google Scholar

Robert, X. & Gouet, P. Entschlüsselung wichtiger Merkmale in Proteinstrukturen mit dem neuen ENDscript-Server. Nukleinsäuren Res. 42, W320–W324 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Diese Studie wurde durch die Zuschüsse 15-15181 S und 18-10687 S der Tschechischen Wissenschaftsstiftung an OV sowie durch den Zuschuss LTC17065 des Ministeriums für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik an OV (im Rahmen der COST-Aktion CA15126 MOBIEU) unterstützt. die Charles University Grant Agency-Projekte 161216 und 1378219 an JB und BK sowie den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (CZ.02.1.01/0.0/0.0/15_003/0000447). Die Mikroskopie wurde im Labor für Konfokal- und Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt, das vom Europäischen Fonds für regionale Entwicklung und dem Staatshaushalt der Tschechischen Republik kofinanziert wurde (Projekte Nr. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 und CZ.2.16/3.1.00). /21515) und unterstützt durch das große RI-Projekt LM2018129 von Czech-BioImaging. Die Rechenressourcen wurden vom Projekt „e-Infrastruktura CZ“ (e-INFRA LM2018140) bereitgestellt, das im Rahmen des Programms „Projekte großer Forschungs-, Entwicklungs- und Innovationsinfrastrukturen“ bereitgestellt wird. Wir anerkennen die Verwendung biophysikalischer CF-Methoden von CMS, CIISB, Instruct-CZ Centre, unterstützt von MEYS CR (LM2018127). Die Autoren danken Dr. Carlos V. Melo für die kritische Korrektur des Manuskripts. Die Autoren danken außerdem für die Unterstützung und Nutzung der Ressourcen von Instruct-ERIC durch die F&E-Pilotprogramme APPID 56 und 286 an OV und JB sowie für das BioStruct-X EC FP7-Projekt 283570. Das Wellcome Center for Human Genetics wird von der unterstützt Wellcome Trust (Zuschuss 090532/Z/09/Z). Wir danken Diamond Light Source für die Strahlzeit (Vorschlag MX10627) und den Mitarbeitern der Strahllinien I03 und 21 für die Unterstützung bei der Datenerfassung.

Jan Blaha

Derzeitige Adresse: EMBL, Hamburg Unit c/o DESY, Notkestraße 85, 22607, Hamburg, Deutschland

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Aktuelle Adresse: School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Nanyang Drive 60, 637551, Singapur, Singapur

Abteilung für Biochemie, Fakultät für Naturwissenschaften, Karls-Universität, Hlavova 2030, 12800, Prag, Tschechische Republik

Jan Bláha, Barbora Kalousková, Ondřej Skořepa, Denis Cmunt, Samuel Pazicky, Edita Poláchová, Celeste Abreu & Ondřej Vaněk

Institut für Biotechnologie, Tschechische Akademie der Wissenschaften, BIOCEV-Zentrum, Průmyslova 595, 25250, Vestec, Tschechische Republik

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Yuguang Zhao & Karl Harlos

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JB, OS, BK, SP, EP und CA trugen zur Proteinexpression und -reinigung bei; JB und YZ führten die Proteinkristallisation durch; YZ und KH führten die Röntgenbeugungsmessungen durch; JB, TS, JS, TK, J.Du. und J.Do. trug zur Datenverarbeitung und Modellverfeinerung bei; OS führte die SEC-SAXS-Datenmessung durch; JB und TS führten die SAXS-Datenanalyse durch; OV führte die analytischen Ultrazentrifugationsmessungen und -analysen durch; JB und BK erfassten und analysierten die dSTORM-Daten; BK, VG und DC führten den NK-Zytotoxizitätstest durch; JB, TS, J.Do. und OV entwarfen die Experimente und verfassten das Manuskript mit kritischem Input von JH

Korrespondenz mit Ondřej Vaněk.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Bláha, J., Skálova, T., Kalousková, B. et al. Die Struktur des NKR-P1:LLT1-Rezeptor:Ligand-Komplexes menschlicher NK-Zellen zeigt eine Clusterbildung in der Immunsynapse. Nat Commun 13, 5022 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32577-6

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Eingegangen: 06. November 2021

Angenommen: 05. August 2022

Veröffentlicht: 26. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32577-6

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