Robuste Ableitung transplantierbarer Dopamin-Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen durch zeitgesteuerte Retinsäureabgabe

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 3046 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Stammzelltherapien für die Parkinson-Krankheit (PD) sind erstmals in klinische Studien am Menschen eingetreten, bei denen eine Reihe technisch verwandter Methoden zur Herstellung mesenzephaler Dopamin-Neuronen (mDA) aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) zum Einsatz kommt. Hier skizzieren wir einen Ansatz für die Gewinnung von mDA-Neuronen mit hoher Ausbeute, der sich grundsätzlich von alternativen Technologien dadurch unterscheidet, dass er Retinsäure (RA)-Signale anstelle von WNT- und FGF8-Signalen verwendet, um das mesenzephale Schicksal zu spezifizieren. Im Gegensatz zu den meisten Morphogensignalen, bei denen die genaue Konzentration das Zellschicksal bestimmt, ist die Dauer der RA-Exposition der Schlüsselparameter für die mesenzephale Spezifikation. Dieser konzentrationsunabhängige Musterungsansatz bietet Robustheit und reduziert die Notwendigkeit von Protokollanpassungen zwischen hPSC-Linien. RA-spezifische Vorläufer differenzieren sich in vitro umgehend in funktionelle mDA-Neuronen und verpflanzen und lindern motorische Defizite nach der Transplantation in einem Ratten-PD-Modell erfolgreich. Unsere Studie bietet einen möglichen alternativen Weg zur Zelltherapie und Krankheitsmodellierung, der aufgrund seiner Robustheit besonders sinnvoll sein könnte, wenn die Verwendung autologer oder immunologisch passender Zellen in Betracht gezogen wird.

Humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) in Form von embryonalen Stammzellen (hESCs) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) stellen eine skalierbare zelluläre Quelle für die Produktion spezifischer Subtypen von Neuronen dar, die für die Hochdurchsatzforschung von Arzneimitteln und Krankheiten genutzt werden können Modellierung oder Zellersatztherapie bei neurodegenerativen Erkrankungen1,2. Mesenzephale Dopamin-Neuronen (mDA) im ventralen Mittelhirn (vMB) sind aufgrund ihrer relativ selektiven Degeneration bei der Parkinson-Krankheit (PD) von besonderem Interesse und da bahnbrechende klinische Experimente mit menschlichem fötalem Mittelhirngewebe den Proof-of-Concept für die Transplantation von Dopamin erbracht haben Neuronen können die Dopamin-Neurotransmission wiederherstellen und bei einigen Parkinson-Patienten eine langfristige Linderung bewirken3.

Methoden zur In-vitro-Ableitung menschlicher mDA-Neuronen für den klinischen Einsatz wurden schrittweise verbessert, und die stammzellbasierte Therapie der Parkinson-Krankheit ist nach umfassender Bewertung der Sicherheit und funktionellen Wirksamkeit in präklinischen Tiermodellen in die spannende Phase klinischer Studien mit allogenen hESCs eingetreten oder hiPSCs als Ausgangsmaterial2,4,5,6. Die Verwendung allogener Zellen ermöglicht die Herstellung großer Chargen gefrorener „Standard“-Präparate, die nach Validierung der Sicherheit und Wirksamkeit in Tiermodellen zur Behandlung vieler Patienten mit demselben Zellprodukt verwendet werden können. Es besteht jedoch ein Nachteil für ein Jahr Immunsuppression, um eine Abstoßung nach der Transplantation zu vermeiden2. Patientenspezifische hiPSCs sind aus immunologischer Sicht optimal, stellen jedoch die erhebliche Herausforderung dar, für jeden einzelnen Patienten hiPSCs in klinischer Qualität zu etablieren und diese Zellen vor der Transplantation effektiv dazu zu bringen, das Schicksal eines mDA-Neurons anzunehmen. Daher ist es unwahrscheinlich, dass patientenspezifische Zellen in diesem Stadium der Entwicklung zu einer Routinetherapie werden, obwohl ein aktueller Fallbericht den Proof-of-Concept lieferte, dass ein autologer Ansatz für die Zelltherapie machbar ist7. Die Verwendung von mit humanem Leukozytenantigen (HLA) übereinstimmenden hiPSC-Linien ist eine alternative Strategie zur Reduzierung der Immunsuppression, erfordert jedoch eine große Anzahl ausgewählter HLA-typisierter hiPSC-Linien, um die Mehrheit der Bevölkerung in einem Land abzudecken8. Ein weiterer interessanter Ansatz besteht darin, universelle „one-fits-all“-hPSC-Linien zu etablieren, die Immuntoleranz ohne die Notwendigkeit einer Immunsuppression bieten könnten9. Es ist jedoch unklar, wann und ob solche Linien für den klinischen Einsatz verfügbar und zugelassen sein werden. Wenn sich die restaurative Zelltherapie in klinischen Studien als sicher und wirksam erwiesen hat, besteht eine wahrscheinliche Entwicklung darin, dass autologe und HLA-angepasste hiPSC-Linien für den routinemäßigen klinischen Einsatz untersucht werden. Neben einer standardisierten Etablierung von GMP-konformen hiPSC-Linien erfordert dies robuste mDA-Neuronenprotokolle, die eine geringe Zelllinien- und Chargenvariabilität als Reaktion auf Strukturierungsmittel aufweisen, um aufwändige Anpassungen für einzelne Zelllinien zu minimieren.

Aktuelle hochmoderne hPSC-basierte mDA-Neuronenprotokolle nutzen ähnliche Sätze von Entwicklungsmustersignalen, um die Differenzierung von hPSCs in Richtung eines mDA-Neuronenschicksals zu steuern. Die duale SMAD-Hemmung (dSMADi) wird angewendet, um die Selektion des neuronalen Schicksals zu fördern, indem hPSCs durch Hemmung der TGF-beta- und BMP-Signalübertragung in frühen Differenzierungsstadien daran gehindert werden, alternative somatische oder extraembryonale Schicksalsoptionen anzunehmen10. Von hPSC abgeleitete neuronale Vorläufer übernehmen ein Schicksal des Vorderhirns (FB), wenn keine Entwicklungsmustersignale vorhanden sind. Die Aktivierung des kanonischen WNT-Signals durch den Glykogen-Synthase-Kinase-3β (GSK3β)-Inhibitor CHIR90021 (CHIR), der häufig zusammen mit FGF8 angewendet wird, wird verwendet, um eine regionale Identität des Mittelhirns (MB) durch Nachahmung der WNT1- und FGF8-Signalisierung zu erzwingen, die vom Isthmus-Organisator ausgehen die MB-Hinterhirn (HB)-Grenze11. Die Aktivierung des SHH-Signalwegs wird wiederum verwendet, um Zellen zu ventralisieren und LMX1A+/FOXA2+/OTX2+-Vorläufer der ventralen Mittelhirnplatte (vMB) zu induzieren, die sich nach Langzeitkultivierung in vitro oder nach Transplantation in PD-Tiermodelle in funktionelle mDA-Neuronen differenzieren können12, 13. Obwohl die Aufgabe, die Dopamin-Neurotransmission wiederherzustellen und motorische Defizite in präklinischen Modellen umzukehren, mit diesen Methoden eindeutig erreicht werden kann, ist die anterior-posteriore (AP) Musterungsreaktion differenzierender hPSCs auf CHIR stark konzentrationsabhängig und erfordert sorgfältige Protokollanpassungen zwischen Zelllinien12, 14,15,16. Die Auswertung einer großen Anzahl von Transplantationsexperimenten ergab weiterhin einen Zusammenhang zwischen experimenteller Variabilität und ungenauer vMB-Spezifikation und Kontamination von dienzephalen Vorläufern trotz optimierter CHIR-Titration, die durch die komplementäre kaudalisierende Aktivität von FGF817 oder mit biphasischer CHIR-Behandlung angepasst werden konnte (CHIR-Boost)18, der die Zwischenhirnkontamination reduzierte und eine kaudalere EN1+ vMB-Identität der Zellen induzierte. Dennoch belegt eine aktuelle Studie, dass die Ablation von 4 kaudalisierenden Mustergenen in hESCs, die HB und das Schicksal des Rückenmarks fördern, zu einer konsistenteren und konzentrationsunempfindlicheren Spezifikation von vMB-Vorläufern durch CHIR führt, was einen genetischen Beweis dafür liefert, dass CHIR-basierte Musterung von Natur aus konzentrationsabhängig ist (Vorabdruck in bioRxiv)19. Die Entwicklung von Methoden, die nicht auf CHIR basieren, um die mesenzephale Identität zu spezifizieren, könnte daher möglicherweise zu robusteren Differenzierungsparadigmen mit geringerer Variabilität von Charge zu Charge und von Zelllinie zu Zelllinie führen. Darüber hinaus wird vorhergesagt, dass die hohen CHIR-Konzentrationen, die zur Durchsetzung der Mittelhirnidentität verwendet werden, zusätzlich zu GSK3β20 ein breites Spektrum an Kinasen hemmen, was einen zusätzlichen Anreiz darstellt, Differenzierungsstrategien in Betracht zu ziehen, die nicht auf CHIR21 basieren.

Der isthmische Organisator ist ein sekundäres Signalzentrum, das entsteht, nachdem die Regionalisierung der rostralen Neuralplatte in Gehirnterritorien eingeleitet wurde22. Die frühe Strukturierung des Gehirns beinhaltet folglich Signale, die vor WNT1 und FGF8 wirken, und bestimmte Beobachtungen deuten darauf hin, dass das Vitamin-A-Derivat Retinsäure (RA) zu diesem Prozess beitragen könnte. Die starke kaudalisierende Aktivität von RA ist gut belegt11. Daher wird allgemein angenommen, dass eine frühe RA-Exposition nicht mit der Ableitung von Neuronen mit einem eher rostralen Ursprung im Zentralnervensystem vereinbar ist, und RA oder Vitamin A werden in hPSC-basierten mDA-Neuronenprotokollen häufig aktiv vermieden15,23,24. Studien haben jedoch über eine kaudale Ausdehnung der FB- und MB-Marker in Wachtelembryos mit Vitamin A-Mangel berichtet25 und es gibt eine rostrale Ausdehnung des HB bei Mäusen, denen die RA-abbauenden Enzyme CYP26A1 und CYP26C126 fehlen. Darüber hinaus haben Studien an Mäusen ein frühes vorübergehendes Zeitfenster definiert, in dem FB-Gewebe durch RA27 in eine MB-ähnliche Identität umgewandelt werden kann. Dies impliziert die Möglichkeit, RA anzuwenden, um hPSC-abgeleiteten NSCs einen Mittelhirncharakter zu verleihen. Es ist auch bekannt, dass RA die Auflösung der Pluripotenz induziert28 und die Reifung naiver NSCs in den Anfangsstadien der neuronalen Entwicklung fördert29 und könnte daher möglicherweise eine schnelle Umwandlung von hPSCs in NSCs fördern. In dieser Studie zeigen wir, dass ein 48-Stunden-RA-Puls in Kombination mit der Aktivierung des SHH-Signalwegs eine schnelle Spezifizierung von LMX1A+/FOXA2+/OTX2+ vMB-Vorläufern fördert, die sich in vitro mit hoher Ausbeute in funktionelle mDA-Neuronen differenzieren und motorische Defizite verpflanzen und wiederherstellen nach Transplantation in ein Rattenmodell der Parkinson-Krankheit. Schließlich könnten wir durch einfaches Anpassen der Dauer der RA-Exposition effektiv serotonerge Neuronen erzeugen. Dies zeigt, dass RA-basierte Musterung in erster Linie auf der Dauer der Signalexposition beruht, und liefert den Proof-of-Concept, dass diese Eigenschaft breit anwendbar ist und zur Produktion genutzt werden kann verschiedene klinisch relevante neuronale Subtypen von hPSCs.

Um die Aktivitäten von RA auf hESCs zu untersuchen, die als Reaktion auf dSMADi10 ein neuronales Schicksal annehmen sollen, behandelten wir Kulturen der GMP-konformen hESC-Linie HS980, die unter dSMADi-Bedingungen gezüchtet wurden, mit 200 nM all-trans RA für die ersten 1, 2, 3 oder 4 Tage Differenzierung (RA1D, RA2D, RA3D, RA4D) (Abb. 1a) und überwachtes Schicksal und Identität von Zellen in verschiedenen Stadien durch Immunblotting, quantitative Immunzytochemie, qPCR oder RNA-Sequenzierung (RNA-seq). In Übereinstimmung mit früheren Studien10 durchliefen Zellen, die im reinen dSMADi-Zustand gezüchtet wurden, zwischen 0 und 7 Tagen im Differenzierungszustand (DDC) einen progressiven Übergang von einem Pluripotenzzustand (OCT4+) in einen naiven NSC-Zustand (SOX1+ PAX6+) (Abb. 1b–d). . OCT4 wurde schrittweise herunterreguliert und näherte sich bei ~5 DDC nicht mehr nachweisbaren Werten, wie durch quantitative Immunzytochemie gezeigt wurde (Abb. 1c). Eine Hochregulierung von SOX1 und PAX6 auf niedrigem Niveau erfolgte bei ~3 DDC (Abb. 1b). OCT4 und SOX1 wurden von Zellen zwischen 3 und 4 DDC gemeinsam exprimiert (Abb. 1b, c und ergänzende Abb. 1a), was zeigt, dass die Umwandlung von hPSCs in NSCs als Reaktion auf dSMADi ein bemerkenswertes Zeitfenster umfasst, über das die Expression von Pluripotenz erfolgt. und neuralspezifische Gene überlappen. Im Gegensatz dazu wurde in Kulturen, die zwei Tage oder länger mit dSMADi und 200 nM RA behandelt wurden (dSMADi + RA2D, 3D), die Induktion von SOX1 und PAX6 bei 2 DDC (Abb. 1e und ergänzende Abb. 1a) und die Expression von OCT4 beobachtet im Wesentlichen durch 3 DDC gelöscht (Abb. 1b, c, f). Die Expressionsniveaus von SOX1 und PAX6 bei 3–4 DDC waren in dSMADi + RA2D-Kulturen im Vergleich zu reinen dSMADi-Kulturen deutlich höher (Abb. 1b, c, f und ergänzende Abb. 1a). Bei 7 DDC war die Expression von SOX1 und dem neuralen Stammzellmarker NESTIN in reinen dSMADi-Kulturen und in dSMADi+RA2D-Kulturen ähnlich (Abb. 1d). Die RNA-seq-Analyse von dSMADi + RA2D-Kulturen deutete auf eine allgemeine Herunterregulierung der Pluripotenzgene und eine Hochregulierung neuronaler linienspezifischer Gene bei 2 DDC hin (Abb. 1e und Ergänzungstabelle 1). Endodermale oder mesodermale Abstammungsmarker wurden nicht hochreguliert (ergänzende Abbildung 1b). Eine sofortige Unterdrückung von OCT4 und eine schnelle Hochregulierung von SOX1 wurden in einem RA-Konzentrationsbereich zwischen 50 und 500 nM erreicht, wenn Zellen unter dSMADi + RA2D-Bedingungen gezüchtet wurden (Abb. 1g). Die Behandlung von Zellen mit 200 nM RA für einen Tag (dSMADi + RA1D) reichte nicht aus, um eine schnelle OCT4-Unterdrückung oder eine schnelle Hochregulierung von SOX1 zu fördern (Abb. 1f), noch war die Behandlung von Zellen nur mit RA (ohne dSMADi) (ergänzende Abb. 1c). Dementsprechend fördert die Kombination von dSMADi mit einer RA-Behandlung für 48 Stunden oder länger einen schnellen und schalterartigen Übergang von einem Pluripotenzzustand in einen NSC-Zustand.

a Schematische Darstellung der hPSC-Differenzierung mit Zeitleiste der Behandlung mit dSMADi und RA. b Immunzytochemie für den Pluripotenzmarker OCT4 und die neuroektodermalen Marker SOX1 und PAX6 auf ESCs und 3-Tage-Kulturen, differenziert in dualen SMAD-Inhibitoren (dSMADi) oder in dSMADi mit einem zweitägigen RA-Puls (dSMADi + RA2D). c Dichtediagramm der Einzelzellexpression von SOX1 und OCT4 in Kulturen, die in dSMADi oder dSMADi+RA2D differenziert wurden, an den angegebenen Tagen unter Differenzierungsbedingungen (DDC). In einer repräsentativen Differenzierung wurden 670-760 Zellen pro Zustand und Zeitpunkt quantifiziert. d Immunzytochemie für die neuralen Vorläufermarker NES und SOX1 sowie Hellfeldbilder (BF) von Kulturen bei 7 DDC, differenziert unter den angegebenen Bedingungen. e RNAseq-basierte log10-fache Änderungswerte der Expression von Genen, die mit Pluripotenz oder neuroektodermalem Schicksal in dSMADi+RA2D-Kulturen bei 2 DDC im Vergleich zu ESCs assoziiert sind. P-Wert und FDR in Ergänzungstabelle 1, n = 2 unabhängige Experimente. f Repräsentativer Western Blot für OCT4 und SOX1 von ESC- und 3 DDC-Kulturen, differenziert unter den angegebenen Bedingungen. g Repräsentativer Western Blot für OCT4 und SOX1 von ESC- und 3 DDC-Kulturen, die unter dSMADi-Bedingungen gezüchtet und zwei Tage lang mit den angegebenen RA-Konzentrationen behandelt wurden. h Immunzytochemie für Marker zur Identifizierung der Regionen Vorderhirn (FOXG1), Vorderhirn und Mittelhirn (OTX2), Hinterhirn (HOXA2) und kaudales Hinterhirn (HOXB4) in neun DDC-Kulturen, die in dSMADi differenziert und wie angegeben mit RA behandelt wurden. i Zusammenfassung der Auswirkungen der RA-Pulsdauer auf die regionale Identität von NSC. Maßstabsbalken, 100 µm. Arb.units beliebige Einheiten, FB-Vorderhirn, MB-Mittelhirn, HB-Hinterhirn.

Um die regionale Identität von hPSC-abgeleiteten NSCs zu bestimmen, die über verschiedene Zeiträume RA ausgesetzt waren, analysierten wir die Expression von Transkriptionsfaktoren, deren Expression allein oder in Kombination zwischen regionalen FB-, MB- oder HB-Identitäten in Kulturen bei 9 DDC unterscheidet. Die dSMADi-Behandlung war in allen folgenden Experimenten enthalten und wird bei der Beschreibung der Versuchsaufbauten nicht weiter hervorgehoben. Wie erwartet erlangten NSCs in hPSC-Kulturen, die nicht mit RA (RA0D) behandelt wurden, eine FOXG1+/OTX2+/HOXA2− FB-ähnliche Identität (Abb. 1h). Ein ähnlicher FB-ähnlicher Charakter wurde in RA1D-Kulturen beobachtet, obwohl der Grad der FOXG1+-Expression etwas verringert war (Abb. 1h und ergänzende Abb. 1d). Interessanterweise wurden in RA2D-Kulturen FB-Marker unterdrückt und NSCs zeigten stattdessen einen FOXG1−/OTX2+/HOXA2− MB-ähnlichen Charakter (Abb. 1h und ergänzende Abb. 1d). In RA3D- und RA4D-Kulturen erwarben NSCs eine FOXG1–/OTX2–/HOXA2+/HOXB4– rostrale HB- bzw. FOXG1–/OTX2–/HOXA2+/HOXB4+ kaudale HB-Identität (Abb. 1h). Diese Daten zeigen, dass ein 48-stündiger RA-Impuls das FB-Schicksal unterdrückt und hPSC-abgeleiteten NSCs eine MB-ähnliche Identität auferlegt, während eine längere Exposition zu einer HB-Identität führt (Abb. 1i).

Als nächstes aktivierten wir die SHH-Signalübertragung, um NSCs eine ventrale Identität zu verleihen, indem wir Kulturen mit dem Smoothened-Agonisten SAG30 zwischen 0 und 9 DDC behandelten, und analysierten das Schicksal von Zellen, die über verschiedene Zeiträume RA ausgesetzt waren, durch Immunzytochemie oder RNA-Seq (Abb. 2a). Bei 9 DDC exprimierten NSCs, die unter Nur-SAG- oder RA1D + SAG-Bedingungen erzeugt wurden, die FB-spezifischen Marker FOXG1, SIX3, SIX6 und LHX2 (Abb. 2b) und den ventralen Marker NKX2.1 (Abb. 2a, b). ein selektiver Marker für das ventrale Telencephalon und Diencephalon31,32. In RA2D + SAG-Kulturen wurden FB-Marker unterdrückt und NSCs nahmen eine LMX1A+/LMX1B+/FOXA2+/OTX2+-Identität an, die für vMB-mDA-Neuronenvorläufer charakteristisch ist (Abb. 2a, b, d). In RA4D + SAG-Kulturen exprimierten Zellen HOX-Gene und die ventralen Marker NKX2.2, PHOX2B, NKX6.1 und NKX6.2, die typisch für kraniale Motoneuron (MN)-Vorläufer des HB33 sind (Abb. 2a, b, d). Hauptkomponenten- und hierarchische Clusteranalysen von RNA-seq-Daten zeigten eine klare Trennung und breite Transkriptionsänderungen zwischen Zellen, die über verschiedene Zeiträume RA ausgesetzt waren (Abb. 2c und ergänzende Abb. 2a). Zusammenfassend belegen diese Daten zunächst, dass eine schrittweise Verlängerung der RA-Expositionsdauer den hPSC-abgeleiteten NSCs immer mehr kaudale regionale Gehirnidentitäten (FB-> MB-> HB) auferlegt (Abb. 1i). Zweitens scheint in Kombination mit der Aktivierung des SHH-Signalwegs ein 48-stündiger RA-Impuls ausreichend zu sein, um NSCs eine LMX1A+/FOXA2+/OTX2+ vMB-ähnliche Identität aufzuzwingen. Eine wirksame Spezifikation einer LMX1A+/FOXA2+ vMB-ähnlichen Identität wurde erreicht, wenn der 48-Stunden-RA-Puls zwischen 0 und 2 DDC eingeleitet wurde (ergänzende Abbildung 2b) und wenn die SAG-Behandlung bei 0 oder 1 DDC eingeleitet wurde (ergänzende Abbildung 2c). bei einer Konzentration ≥50 nM (Ergänzende Abb. 2d).

a Schematische Darstellung der hPSC-Differenzierung mit Zeitleiste der Behandlung mit RA und SHH-Signalaktivator (SAG) (oben). Alle Kulturen wurden unter dSMADi-Bedingungen differenziert, wie in Abb. 1a angegeben. Immunzytochemie für angegebene Marker bei 9 DDC in Kulturen, die im +SAG-Zustand differenziert und 1, 2 oder 4 Tage lang mit RA gepulst wurden (unten). b Normalisierte Genexpression der angegebenen Gene in 9 DDC-Kulturen, differenziert in +SAG und behandelt mit RA für die angegebene Zeit (n = 2 unabhängige Experimente pro Bedingung). c Heatmap und hierarchisches Clustering unterschiedlich exprimierter Gene von 9 DDC-Kulturen, differenziert in +SAG und behandelt mit RA für die angegebene Zeit (n = 2 unabhängige Experimente pro Bedingung). d Schematische Darstellung der Genexpressionsprofile, die unterschiedliche ventrale Vorläufer im Zwischenhirn (Di), Mittelhirn (MB) und Hinterhirn (HB) definieren. e Expression von Genen, die mit den angegebenen regionalen Vorläufern bei 14 DDC assoziiert sind, in Kulturen, die in +SAG + RA2D differenziert sind, in zwei unabhängigen Experimenten. f Repräsentative Immunzytochemie für β-CATENIN (links) und Boxplots der β-CATENIN-Kernspiegel (rechts) in 2 DDC-Kulturen, differenziert in +SAG (Kontrolle) und behandelt mit RA oder CHIR99021. Boxplot-Daten: Die Mittellinie definiert den Median, die Box gibt Quartil 1 bis Quartil 3 an und Whiskers zeigen den ±1,5-fachen Interquartilbereich an. n = 227 (Kontrolle), 247 (RA), 232 (CHIR99021) Zellen, untersucht über 3 unabhängige Differenzierungen, p-Werte abgeleitet aus ungepaartem zweiseitigem t-Test. g Immunzytochemie für die angegebenen Marker in Kulturen bei 14 DDC, differenziert in dSMADi+SAG + RA2D. h qPCR-Analyse eines Panels von 17 Genen für sechs unabhängige mDA-Differenzierungen bei 14 DDC (RA2D + SAG-Spalte; Differenzierungen Nr. 1–Nr. 6). mDA-Proben wurden mit Kulturen verglichen, die auf eine Vorderhirn- (RA0D + SAG, n = 2) oder Hinterhirn-Vorläuferidentität (RA4D + SAG, n = 2) differenziert waren. i Quantifizierung des Prozentsatzes der Zellen, die FOXA2, LMX1A oder NKX2.1 exprimieren, in 14 DDC-Kulturen, differenziert in +RA2D + SAG über vier verschiedene hPSC-Linien (Werte, Mittelwert ± SD, n = 3–4). Maßstabsbalken: 100 µm in Panels (a, g), 25 µm Panel (f).

Eine LMX1A+/LMX1B+/FOXA2+/OTX2+-Identität galt lange Zeit als molekulares Kennzeichen für vMB-Vorläufer, die mDA-Neuronen erzeugen, es wurde jedoch gezeigt, dass diese Identität auch von ventralen Vorläufern des kaudalen Zwischenhirns geteilt wird, wodurch Neuronen des Nucleus subthalamicus (STN) entstehen17,32 (Abb. 2d). BARHL1, BARHL2, PITX2 und NKX2.1 werden selektiv von der STN-Linie exprimiert und können daher zur Unterscheidung zwischen dienzephalen STN-Vorläufern und vMB-Vorläufern verwendet werden32. Analysen von RA2D + SAG-Kulturen nach 14 Tagen zeigten, dass die überwiegende Mehrheit der LMX1A+-Zellen FOXA2, OTX2 und LMX1B sowie den vMB-Marker CORIN34 koexprimierte (Abb. 2g; LMX1A+FOXA2+: 92,5 % ± 3,3, OTX2+: 97,3). % ± 1,7, Mittelwert ± SD, n = 4). Zu diesem Zeitpunkt hatte eine kleine Untergruppe von Zellen die Expression von NURR1 (Abb. 2g) initiiert, einem frühen Marker für postmitotische mDA-Neuronen35. RNA-seq-Daten zeigten eine vernachlässigbare Expression von BARHL1, BARHL2, PITX2 und NKX2.1 (Abb. 2e) und seltene LMX1A+- oder LMX1B+-NSCs, die NKX2.1, PITX2 oder BARHL1 koexprimierten (Abb. 2g; NKX2.1+: 2,1 % ± 2 (n = 3), PITX2+: 1,4 ± 0,8 (n = 2); Mittelwert ± SD) in 14 DDC-Kulturen. Die Expression von NKX2.2, PHOX2B, PHOX2A und NKX6.1 entweder allein oder in Kombination definiert Vorläufer, die kraniale Motoneuronen (MNs) und serotonerge Neuronen (5HTNs) im ventralen HB33,36 oder okulomotorische Neuronen37 und daraus abgeleitete GABAerge Neuronen38 hervorbringen lateral zu mDA-Neuronen im MB (Abb. 2d). RNA-seq-Daten zeigten eine geringe Expression dieser Marker in RA2D + SAG-Kulturen (Abb. 2e) und wenige Zellen exprimierten NKX2.2, PHOX2A, PHOX2B und NKX6.1 bei 14 DDC, wie durch Immunzytochemie bestimmt (Abb. 2g). qPCR-Analysen von sechs biologischen Replikaten von RA2D + SAG-Kulturen, die bei 14 DDC isoliert wurden, zeigten eine konsistente vMB-Spezifikation und eine geringe Expression ungeeigneter regionaler Marker (Abb. 2h).

Die vom isthmischen Organisator ausgehenden WNT1- und FGF8-Signale bewirken einen Gradienten der EN1- und EN2-Expression im MB39,40 von kaudal-hoch nach rostral-niedrig. EN1, EN2, WNT1, FGF8 und die isthmischen Marker PAX2, PAX5 und PAX8 wurden bei 14 DDC in sehr geringen oder nicht nachweisbaren Mengen exprimiert (Abb. 2e). Die Aktivierung des kanonischen WNT-Signals durch CHIR99021 ist mit der Translokation von β-Catenin in Kerne verbunden (Abb. 2f). Es gab keine nukleare Akkumulation von β-Catenin als Reaktion auf die RA-Behandlung (Abb. 2f) und keine Induktion von WNT1 oder dem WNT-Reaktionsgen AXIN2 oder FGF8 als Reaktion auf RA in ESC-Kulturen bei 2 DDC bis 14 DDC (Abb. 2e und ergänzende Abb. 2e) Zusammengenommen legt dies nahe, dass durch RA und SAG induzierte LMX1A+/FOXA2+/OTX2+-Zellen eine EN1−/LOW-rostralähnliche vMB-Identität erwerben und dass die Spezifizierung des vMB-Schicksals unabhängig von WNT1, FGF8 oder Induktion erfolgen kann von isthmischen Organizer-ähnlichen Zellen in hPSC-Kulturen.

Als nächstes verglichen wir die Musterreaktion auf die RA2D + SAG-Behandlung für eine weitere hESC-Linie HS401 sowie zwei hiPSC-Linien SM55 und SM56. Für jede bei 14 DDC analysierte Zelllinie beobachteten wir eine konsistente Induktion von LMX1A+/FOXA2+/OTX2+/NKX2.1− vMB-Vorläufern mit hoher Ausbeute, ohne dass die Konzentration oder die Zeit der RA-Exposition angepasst werden musste (Abb. 2i und ergänzende Abb. 3). Dies würde normalerweise eine Neutiterierung der Strukturierungsmittel unter Verwendung anderer mDA-Neuronenprotokolle erfordern, bei denen CHIR zur Kaudalisierung verwendet wird15. Insgesamt legen diese Daten nahe, dass die RA-basierte Differenzierung eine robuste und reproduzierbare vMB-Spezifikation mit hoher interexperimenteller Konsistenz und geringer Zelllinienvariabilität fördert.

Um die robuste Musterungsaktivität von RA zu verstehen, untersuchten wir die Musterungsausgabe als Reaktion auf veränderte RA-Konzentrationen. In diesen Experimenten wurden unter RA2D + SAG-Bedingungen kultivierte Zellen RA im Bereich von 100–800 nM ausgesetzt und die regionale Identität der Zellen wurde bei 9 DDC analysiert. In Kulturen, die 200–400 nM RA ausgesetzt waren, exprimierte die überwiegende Mehrheit der NSCs eine LMX1A+/NKX2.1− vMB-Identität und nur wenige Zellen exprimierten eine dienzephale LMX1A+/NKX2.1+-Identität oder NKX2.2+/LMX1A− HB-ähnliche Identität Identität (Abb. 3a, c). Es ist bemerkenswert, dass einige LMX1A+ bei 9 DDC NKX2.2 in sehr geringen Mengen koexprimierten (ergänzende Abbildung 2c), was mit Daten übereinstimmt, die zeigen, dass NKX2.2 in vMB-Vorläufern in frühen Entwicklungsstadien in vivo vorübergehend exprimiert wird . LMX1A+/NKX2.1− vMB-Vorläufer wurden auch erzeugt, wenn die RA-Konzentration auf 100 nM reduziert oder auf 800 nM RA erhöht wurde, jedoch mit einer geringeren Ausbeute (Abb. 3c). Als wir CHIR zur Spezifizierung der vMB-Identität verwendeten, erreichten die Zellen als Reaktion auf 1 µM CHIR eine LMX1A+/NKX2.1− vMB-Identität, aber die regionale Identität von NSCs verschob sich in einen anterioren dienzephalen LMX1A+/NKX2.1+-Charakter, als die Konzentration reduziert wurde auf 0,8 und 0,6 µM (Abb. 3b, c) oder in eine posteriore NKX2.2+/LMX1A− mutmaßliche HB-Identität, wenn die Konzentration auf 1,2 und 1,4 µM erhöht wurde (Abb. 3b, c). Diese Daten zeigen, dass die Spezifikation der vMB-Regionalidentität relativ tolerant gegenüber veränderten RA-Konzentrationen ist und dass stattdessen die Dauer der RA-Exposition für eine robuste vMB-Musterung von zentraler Bedeutung ist.

a–c Auswirkung von Änderungen in der Konzentration von RA (a) oder CHIR99021 (b) auf die Expression von Markern, die das ventrale Vorderhirn (NKX2.1+LMX1A+), das Mittelhirn (NKX2.1−LMX1A+) oder das Hinterhirn (NKX2.2+) definieren 9 DDC-Kulturen differenzierten in dSMADi+SAG und entsprechende Quantifizierung der NKX2.1+LMX1A+- und NKX2.1−LMX1A+-Populationen (n = 3 unabhängige Differenzierungen pro Bedingung). Werte, Mittelwert ± SD (c). d Wirkung der RA-Konzentration (50, 100, 300, 500 und 1000 nM RA) auf die CYP26A1-Expression in 1 DDC-Kulturen, differenziert in dSMADi (Daten aus zwei unabhängigen Differenzierungen). e Zeitliches Expressionsprofil von CYP26A1 in Kulturen, die in dSMADi differenziert und 2 Tage lang ohne RA oder 300, 500 oder 1000 nM RA gepulst wurden (Daten aus zwei unabhängigen Differenzierungen). f Wirkung der Hemmung der CYP26-Aktivität mit 500 nM R115866-Inhibitor auf die Expression von NKX2.1, LMX1A und PHOX2B bei 9 DDC in Kulturen, die in SAG differenziert sind und auf RA-Erkrankungen hinweisen. g Relative Genexpression der angegebenen Gene in 9 DDC-Kulturen, differenziert im RA1D + SAG-Zustand und in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen des CYP26-Inhibitors R115866 (Daten aus zwei unabhängigen Differenzierungen). h, i Immunzytochemie von NKX2.1, LMX1A und PHOX2B bei 9 DDC in Kulturen, die in dSMADi plus den angegebenen Bedingungen (500 nM 9-cis-RA, 13-cis-RA und TA; 200 nM EC23) differenziert wurden, und in Gegenwart oder Fehlen von 500 nM R115866. j Schematische Zusammenfassung der regulatorischen Wechselwirkungen zwischen RA und CYP26A1. Maßstabsbalken 100 µm.

Die CYP26-Genfamilie (CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1) kodiert Enzyme der Cytochrom-p450-Familie, die RA durch Oxidation metabolisieren41. CYP26A1 wird vom rostral gelegenen Neuroektoderm exprimiert und trägt dazu bei, eine rostrale Erweiterung der HB-Identität in frühen Stadien der neuralen Entwicklung zu verhindern26. Auch bei der anterior-posterioren Strukturierung des HB ist die negative Rückkopplungsregulation der RA-Signalübertragung durch selbstverstärkten Abbau durch Induktion von CYP26-Proteinen von zentraler Bedeutung für die Gestaltung von RA-Gradienten und die Pufferung von Schwankungen der RA-Spiegel42,43. Wir beobachteten eine RA-konzentrationsabhängige Aktivierung und ein adaptives zeitliches Expressionsprofil von CYP26A1 in hPSC-Kulturen (Abb. 3d, e). Dies liefert eine plausible mechanistische Begründung für die robuste Musterreaktion von hPSCs auf RA, da veränderte RA-Eingaben durch eine entsprechende Änderung der RA-Umsatzrate durch CYP26A1 gepuffert werden können. Um dies zu untersuchen, untersuchten wir die Musterbildungsausgabe als Reaktion auf eine zeitgesteuerte RA-Exposition nach Hemmung der CYP26-Aktivität mit dem selektiven Antagonisten R11586644 zwischen 0 und 3 DDC. In RA1D + SAG- oder RA2D + SAG-Kulturen, die mit 500 nM R115866 behandelt wurden, erlangten die Zellen bei 9 DDC eine PHOX2B+ HB-Identität anstelle einer NKX2.1+ FB-Identität bzw. LMX1A+/NKX2.1− vMB-Identität (Abb. 3f). In diesen Experimenten wurden HOXA2 und HOXB4 induziert, was auf eine kaudale HB-Identität schließen lässt (Abb. 3g), die einer regionalen Identität entspricht, die nach vier Tagen RA-Exposition erworben wurde, wenn die CYP26-Funktion intakt bleibt (Abb. 1h). Als die R115866-Konzentration auf 100 nM reduziert wurde, wurde das FB-Schicksal unterdrückt, aber die Kulturen enthielten eine Mischung aus LMX1A+/NKX2.1− vMB-Zellen und PHOX2B+ HB-Zellen (Abb. 3g und ergänzende Abb. 4a), was vermutlich eine teilweise Hemmung von widerspiegelt CYP26A1 erzeugt eine intermediäre kaudalisierende Wirkung. Wichtig ist, dass die Behandlung von Zellen nur mit R115866 und SAG das Schicksal von NKX2.1+ FB nicht unterdrückte (Abb. 3f), was belegt, dass die starke kaudalisierende Wirkung von R115866 RA-abhängig ist.

Wie all-trans-RA sind 9-cis-RA, 13-cis-RA und das xenobiotische RA-Analogon Tazarotensäure (TA) Substrate für die CYP26-vermittelte Oxidation45,46. Die 48-stündige Exposition von Zellen gegenüber 500 nM dieser Analoga ahmte die Strukturierungsaktivität von all-trans RA nach, indem eine LMX1A+/NKX2.1− vMB-Identität eingeführt wurde (Abb. 3h und ergänzende Abb. 4b), was zu einer Hemmung der CYP26-Aktivität führte in einer Verschiebung in eine PHOX2B+ HB-Identität (Abb. 3h). Es wird vorhergesagt, dass das synthetische RA-Analogon EC23 gegen CYP26-vermittelte Oxidation resistent ist47 und als all-trans-RA durch 200 nM EC23 ersetzt wurde, nahmen Zellen, die entweder unter EC231D + SAG- oder EC232D + SAG-Bedingungen gezüchtet wurden, eine PHOX2B+ HB-Identität sowohl mit oder an ohne Hemmung von CYP26 (Abb. 3i und ergänzende Abb. 4a). Titrationsexperimente zeigten, dass EC23 LMX1A+/NKX2.1− vMB-Zellen induzieren konnte, dies war jedoch ungenau und erforderte eine 20-fache Reduzierung der Konzentration und eine Behandlung der Zellen nur für 24 Stunden (ergänzende Abbildung 4c). Zusammengenommen belegen diese Daten, dass der AP-Muster-Output als Reaktion auf eine zeitgesteuerte RA-Exposition entscheidend von der RA-konzentrationsabhängigen Aktivierung von CYP26A1 in reagierenden hPSCs abhängt und liefern eine mechanistische Begründung zur Erklärung der Robustheit und Toleranz gegenüber verändertem RA-Input bei RA- vermittelte vMB-Spezifikation (Abb. 3j).

Ein einzigartiges Merkmal von mDA-Neuronen besteht darin, dass sie aus zunächst nicht-neuronalen Bodenplattenzellen (FP) stammen und Vorläufer daher vor der Differenzierung in Neuronen neuronales Potenzial erwerben müssen34,48. Nur wenige Marker unterscheiden zwischen diesen vMB-Reifungsstadien, aber eine Herunterregulierung von SHH und eine Hochregulierung von proneuralen bHLH-Proteinen im Laufe der Zeit korrelieren mit diesem Übergang48. RNA-seq-Analysen von RA2D + SAG-behandelten Zellen, die bei 9, 12, 14 und 21 DDC isoliert wurden, zeigten, dass die Expression der Pan-FP-Marker SHH, CORIN, ARX, VTN, FERD3L, NTN1, SLIT2, SULF2 und ALCAM ihren Höhepunkt erreichte um 12-14 DDC und ging anschließend zurück (Abb. 4a, ergänzende Abb. 5a und ergänzende Tabelle 2). Umgekehrt wurden NEUROG2, NEUROG1, NEUROD4 und ASCL1, die für proneurale bHLH-Proteine ​​kodieren, bei 21 DDC hochreguliert (Abb. 4a), ebenso wie die mDA-Neuronenmarker NR4A2 (NURR1) und TH und die panneuronalen Marker DCX, TUBB3, und STMN2 (Abb. 4a und Ergänzungstabelle 2). Immunzytochemische Analysen bestätigten, dass die SHH-Expression bei 14 DDC im Vergleich zu 21 DDC höher war und dass die Anzahl der NEUROG2+-Vorläufer in diesem Zeitraum zunahm (Abb. 4b). Zwischen 14 und 21 DDC kam es zu einer fortschreitenden Akkumulation von HuC/D+-Neuronen (Abb. 4c, d), und bei 21 DDC machten ~30 % der DAPI+-Zellen HuC/D+-Neuronen in RA2D + SAG-Kulturen aus (Abb. 4d). . Viele von ihnen hatten auch die Expression von TH initiiert (Abb. 4c). Als wir CHIR + SAG anwendeten, um LMX1A+/NKX2.1− vMB-Vorläufer zu spezifizieren (Abb. 3b), initiierten die Zellen die Neurogenese bei etwa 17 DDC (Abb. 4c, d), was mit früheren Studien 13, 15 übereinstimmt. Bei 21 DDC machten HuC/D+-Neuronen etwa 10 % der gesamten Zellen aus und nur wenige Neuronen exprimierten TH (Abb. 4c, d). Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet, wenn CHIR + SAG-behandelte Kulturen mit einer FGF8b-Behandlung zwischen 9 und 16 DDC15,17 ergänzt wurden (Abb. 4c). Dies weist darauf hin, dass RA-spezifische vMB-Vorläufer die Neurogenese früh einleiten und dass Zellen auf Populationsebene eine relativ koordinierte Umwandlung von einem unreifen FP-Zustand in einen neurogenen mDA-Neuron-Vorläuferzustand durchlaufen.

a–r Analyse von Kulturen, die in dSMADi+RA2D + SAG (a, b, e–r) oder dSMADi+SAG differenziert wurden und eine RA-, CHIR99021- oder CHIR99021 + FGF8-Erkrankung anzeigten (c, d). Eine RNAseq-basierte log2-fache Änderung der Expressionswerte von Genen, die mit der Bodenplattenidentität und Neurogenese assoziiert sind, bei 21 DDC im Vergleich zu 14 DDC. P- und FDR-Werte in Ergänzungstabelle 2, Daten aus zwei unabhängigen Experimenten (n = 2). b SHH-, LMX1A- und NEUROG2-Immunzytochemie bei 14 und 21 DDC. c Immunzytochemie des neuronalen Markers HuC/D bei 17 DDC und des dopaminergen Neuronenmarkers TH bei 21 DDC unter den angegebenen Bedingungen. d Quantifizierung von HuC/D+-Neuronen bei 14, 17 und 21 DDC unter den angegebenen Bedingungen (n = 2). e–i Immunzytochemie der angegebenen Marker (e, f, h) und Quantifizierung von TH+-Zellen, die FOXA2 oder LMX1B exprimieren (n = 4 bzw. n = 5) (g) und von dopaminergen (TH+, n = 7), GABAergen (GABA+, n = 6), motorische (PRPH+, n = 7) und serotonerge (5-HT+, n = 7) Neuronen bei 33–35 DDC. i Werte, Mittelwert ± SDTH/Tuj und 5-HT/Tuj-Bilder in (h) entsprechen einer dreifachen 5-HT/TH/Tuj-Immunzytochemie. j, l Immunzytochemie der angegebenen Marker in 40–45 DDC-Kulturen. k Violindiagramme der Neuritenlänge (Mittellinie, Mittelwert; p-Wert aus paarweisem Wilcoxon-Test) und der Quantifizierung der Neuritenverzweigung (Mittellinie, Mittelwert) in 30 und 40 DDC TH+-Neuronen, n = 40 Neuronen pro Zeitpunkt. m qPCR von mDA-Markern während der mDA-Differenzierung (n = 3, außer für 21 DDC, wo n = 2). n Quantifizierung von TH+-Zellen, die EN1 bei 35–40 DDC exprimieren (n = 3). Daten in (m,n) als Mittelwert ± SD o HPLC-Nachweis von Noradrenalin (NA), Dopamin (DA) und Serotonin (5-HT) im Überstand von 42 DDC-Kulturen. p Quantifizierung der Dopaminspiegel in Medien bei 42 DDC in der Kontrolle (n = 12) oder nach KCL-induzierter Dopaminfreisetzung (n = 12) und im gesamten Zelllysat (n = 6). Werte dargestellt als Mittelwert ± SEM, p-Wert aus zweiseitigem ungepaartem t-Test. q Zellgebundene Aufzeichnung, die spontane Aktionspotentiale (links) und isolierte spontane Aktionspotentiale (rechts) von Zellen bei 40–45 DDC zeigt. Graue Pfeilspitzen kennzeichnen spontane Spitzen. r Immunzytochemie für TH an Biocytin-markierten Neuronen (links) und evoziertem Spike-Train (rechts) in 40 DDC-Neuronen. Schematische Zusammenfassung des Differenzierungszeitplans. Maßstabsbalken: 100 µm in (b, c, e, h, j) und 50 µm (f, l, r).

RA-spezifizierte TH+-Neuronen erlangten eine zunehmend fortgeschrittenere neuronale Morphologie mit fortschreitendem Wachstum und Verzweigung axonaler Prozesse zwischen 30 und 45 DDC (Abb. 4e, j, k). TH+-Neuronen exprimierten die mDA-Neuronenmarker LMX1B, LMX1A, FOXA2, NURR1 und OTX2 bei 30–35 DDC (Abb. 4 e–g). Nur seltene Zellen exprimierten Ki67 oder Phosphohiston H3 bei 35–40 DDC (ergänzende Abbildung 5b), was auf eine geringe mitotische Aktivität in Langzeitkulturen hinweist. ~80 % aller Neuronen exprimierten TH+ bei 35 DDC (Abb. 4h, i). ~ 10 % der Neuronen exprimierten GABA (Abb. 4h, i) und einige davon exprimierten TH (ergänzende Abb. 5b). Es wurden nur seltene Neuronen entdeckt, die 5-HT oder den MN-Marker PRPH exprimieren (Abb. 4h, i). Es wurde bestätigt, dass alle vier in dieser Studie untersuchten hPSC-Linien in Langzeitkulturen einen hohen Gehalt an TH + -Neuronen (~ 60–80% der gesamten Neuronen) hervorrufen (ergänzende Abbildung 5c).

Zeitliche mRNA-Expressionsanalysen ergaben eine bemerkenswerte Hochregulierung von EN1 in ESC-Kulturen bei 40 DDC (Abb. 4m) und ein kleiner Teil der TH+-Neuronen (~15 %) exprimierte nachweisbares EN1 basierend auf der Immunzytochemie (Abb. 4l, n). Während unreife RA-spezifizierte rostralähnliche vMB-Vorläufer eine vernachlässigbare EN1-Expression zeigen (Abb. 4m), deutet dies darauf hin, dass EN1 im Laufe der Zeit bei der Differenzierung von mDA-Neuronen hochreguliert wird (siehe auch unten). Die Zellen exprimierten auch die mDA-Neuronenreifungsmarker DAT, GIRK2, SYNAPTOPHYSIN, CALB1, SOX6, VMAT2 und ALDH1A1 bei 40 DDC, wie durch Immunzytochemie (Abb. 4l und ergänzende Abb. 5b, d) oder mRNA-Expression (Abb. 4m) bestimmt. Analysen mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bei 42 DDC ergaben, dass Neuronen Dopamin produzierten und freisetzten (Abb. 4o, p), nicht jedoch Serotonin (5-HT) oder Noradrenalin (NA) (Abb. 4o). Die Zeit, in der hPSC-abgeleitete Zellen spontane Aktionspotentiale, evozierte Aktionspotentiale und spannungsabhängige Na+- und K+-Ströme erwerben, stellt ein weiteres Maß zur Bewertung des Reifungszustands von mDA-Neuronen in vitro dar49. In RA2D + SAG-Kulturen war die Anzahl der gepatchten Zellen, die spannungsabhängige Na+- und K+-Ströme zeigten, bei 35 DDC niedrig, stieg jedoch bei 38 DDC deutlich an und blieb danach auf einem weitgehend konstanten Niveau (ergänzende Abbildung 6), und Neuronen zeigten spontane Ergebnisse (Abb. 4q) oder evozierte Aktionspotentiale (Abb. 4r) wurden bei 40–45 DDC aufgezeichnet. Zusammenfassend belegen diese Daten, dass RA-spezifizierte vMB-Vorläufer in vitro mit hoher Ausbeute in funktionelle mDA-Neuronen differenzieren (Abb. 4s), wobei die neuronalen Subtypen, die in unmittelbarer Nähe zu mDA-Neuronen im sich entwickelnden Hirnstamm erzeugt werden, nur wenig kontaminiert sind.

Um die In-vivo-Leistung von vMB-Vorläufern zu bestimmen, die als Reaktion auf RA2D + SAG spezifiziert wurden, haben wir vMB-Präparate in ein präklinisches PD50-Rattenmodell transplantiert. vMB-Vorläufer wurden bei 14 DDC isoliert (Abb. 4s) und auf das Striatum athymischer (nackter) Ratten mit vorheriger einseitiger 6-OHDA-Läsion am medialen Vorderhirnbündel transplantiert, wie zuvor beschrieben (ergänzende Abb. 7a). Sieben Monate nach der Transplantation zeigte die immunhistochemische Analyse, dass alle neun Ratten überlebende neuronenreiche Transplantate mit umfassender Innervation der DA-Zielregionen, einschließlich des dorsolateralen Striatums und des präfrontalen Kortex, hatten (Abb. 5a). Die Transplantate enthielten eine große Anzahl von TH+-Neuronen (4300 ± 47 TH+-Neuronen pro Transplantat, Abb. 5b), die gemeinsam mit dem menschlichen Marker HuNu markiert waren (Abb. 5c, d und ergänzende Abb. 7b). Von Transplantaten abgeleitete TH+-Neuronen exprimierten auch FOXA2, LMX1A/B, PITX3, NURR1 und EN1 (Abb. 5e – j), was darauf hinweist, dass sie auch nach der Transplantation einen mDA-Phänotyp annahmen. ~70 % der TH+-Neuronen exprimierten nach der Transplantation nachweisbares EN1, was zeigt, dass die Mehrheit der RA-spezifizierten mDA-Neuronen nach Differenzierung und Reifung in vivo EN1 exprimierten (Abb. 5n). ≥70 % der TH+-Neuronen exprimierten auch PITX3 sowie GIRK2 und SOX6, bei denen es sich um Marker handelt, die im therapeutischen A9-Subtyp von mDA-Neuronen angereichert sind (Abb. 5i – l, n). Die A9-Identität wurde weiter durch TH+-Fasern gestützt, die das umgebende dorsolaterale Striatum innervierten (Abb. 5a und ergänzende Abb. 7c). Innervation wurde auch im präfrontalen Kortex festgestellt und ein kleiner Teil der TH+-Neuronen exprimierte CALB1 (20,5 % ± 4,7, Mittelwert ± SD) (Abb. 5m, n), einen Marker, der mit A10-Subtypen von mDA-Neuronen angereichert ist51. Die Funktionalität der TH+-Neuronen wurde mithilfe medikamenteninduzierter und spontaner motorischer Tests beurteilt; Amphetamin-induzierter Rotations- und Schritttest, der eine funktionelle Erholung 7 Monate nach der Transplantation zeigte (Abb. 5o – q). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass von RA und SAG spezifizierte hPSC-abgeleitete vMB-Vorläufer erfolgreich transplantieren, Projektionen auf relevante Zielbereiche ausweiten und sich in funktionelle mDA-Neuronen differenzieren, die motorische Defizite in einem PD-Tiermodell in einem mit dem bisherigen Ausmaß vergleichbaren Ausmaß wiederherstellen Berichtet von Zellen, die mit CHIR-basierten Musterprotokollen erzeugt wurden13,17,52,53.

a–m Immunhistologische Analyse von Ratten mit einseitiger 6-OHDA-Läsion sieben Monate nach der Transplantation von vMB-Präparaten in das Striatum. a Überblick über die vom Transplantat abgeleitete Innervation des Wirtshirns, markiert mit der von DAB entwickelten hNCAM-Färbung, und Vergrößerung des menschlichen neuronalen Faserauswuchses in Richtung präfrontaler Kortex (PFC) und dorsolaterales Striatum (DLstr). b TH-Expression in Striatum und Substantia nigra (SN). Beachten Sie die TH-Immunreaktivität im gesamten Striatum und das Fehlen einer TH-Expression im SN auf der verletzten Seite (rechts). c–m Immunhistochemie der angegebenen Marker in Transplantaten. n Quantifizierung des Prozentsatzes an TH+-Zellen in Transplantaten, die EN1, SOX6, GIRK2 (n = 6 Ratten), PITX3 oder CALB1 (n = 4 Ratten) exprimieren. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. o Quantifizierung der Nettorotationen pro Minute bei Ratten mit Ausgangswerten für amphetamininduzierte Rotationen von ≥ 5 ipsilateralen Drehungen pro Minute (n = 5 Ratten) nach der Läsion und sieben Monate nach der Transplantation. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM, p-Wert aus dem zweiseitigen T-Test mit ungleicher Varianz nach Welch dargestellt. p Rotationsverhalten über die Zeit nach Verabreichung von Amphetamin vor (durchgezogene Linien) und sieben Monate nach (gestrichelte Linien) der Transplantation aller transplantierten Tiere (n = 9 Ratten). q Bevorzugung der Verwendung der kontralateralen Pfote nach der Läsion und sieben Monate nach der Transplantation. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 9 Ratten) dargestellt. o–q Dieselben Ratten, die nach der Läsion analysiert wurden, wurden sieben Monate nach der Transplantation analysiert. Maßstabsbalken: 1000 µm in (a). links und (b), 100 µm in (a). Rechts; 25 µm in (d, e, f, I, j, k); 10 µm in (c, g, h, l, m).

Während sich unsere Studie auf die RA-basierte Spezifikation von mDA-Neuronen konzentriert, sollte die zeitgesteuerte RA-Exposition allgemein für die Spezifikation verschiedener Arten klinisch relevanter Neuronen aus hPSCs anwendbar sein. Beispielsweise induziert eine längere RA-Exposition (≥ 3 Tage) zusammen mit der Aktivierung des SHH-Signalwegs NKX2.2+ HB-ähnliche Vorläufer (Abb. 2a, b), von denen bekannt ist, dass sie nacheinander kraniale PHOX2B+-Motoneuronen (MN) und serotonerge Neuronen (5HTNs) erzeugen ) während der Entwicklung von Mäusen und Menschen36,54. Da 5HTNs ein breites Spektrum physiologischer Prozesse und Verhaltensweisen modulieren und an der Pathophysiologie eines Spektrums psychiatrischer Erkrankungen beteiligt sind55,56, haben wir untersucht, ob eine zeitgesteuerte RA-Behandlung auch eine Strategie für die Produktion menschlicher 5HTNs16,55 darstellen könnte (Abb. 6a). ). Das Zeitfenster, in dem MNs produziert werden, wird durch die Koexpression von NKX2.2 und der MN-Determinante PHOX2B in Vorläufern definiert57. In RA4D + SAG-Kulturen wurden NKX2.2 und PHOX2B zwischen ~9 und 16 DDC koexprimiert (Abb. 6b) und es kam in diesem Zeitraum zu einer fortschreitenden Akkumulation differenzierender MNs, was durch das Vorhandensein von PHOX2B+/NKX2 bestimmt wurde. 2−-Zellen bei 17 DDC und PHOX2B+/PRPH+/ISL1+/ISL2+- und PHOX2B+/TuJ1+-Neuronen bei 19 DDC (Abb. 6b). Bei 17 DDC war PHOX2B in den meisten NKX2.2+-Vorläufern herunterreguliert und Zellen, die den 5HTN-Abstammungsmarker GATA3 exprimierten, begannen aufzutauchen (Abb. 6b), was darauf hindeutet, dass die Vorläufer zu diesem Zeitpunkt einen Schicksalswechsel von MN zu 5HTN durchliefen. Um die Menge an frühgeborenen MNs in Kultur zu reduzieren, führten wir einen Dissoziationsschritt bei 24 DCC ein, da differenzierte Neuronen im Vergleich zu unreifen Vorläufern eine geringere Fähigkeit zeigten, sich wieder an die Kulturschale zu binden (Abb. 6a). Mit dieser Methode konnten wir die Anzahl der PHOX2B+-MNs in Kultur bei 34 DDC auf ~6 % reduzieren (Abb. 6c, d) und erreichten Kulturen, in denen ~60–65 % der gesamten HuC/D+-Neuronen 5-HT und molekular exprimierten Für 5HTNs charakteristische Marker wie GATA3, LMX1B, Tryptophanhydroxylase 2 (TPH2), Serotonintransporter (SERT) und der 5-HT1A-Autorezeptor (5-HT1AR) (Abb. 6c – e). Zusammengenommen liefern diese Daten den Beweis dafür, dass eine zeitlich begrenzte Dauer der RA-Exposition für eine wirksame In-vitro-Ableitung menschlicher 5HTNs angewendet werden kann.

eine schematische Zusammenfassung der Differenzierungsbedingungen und -prozesse während der MN- und 5HTN-Erzeugung. b Immunzytochemie von NKX2.2, PHOX2B und GATA3 bei 9 und 17 DDC und von Tuj1, PRPH, PHOX2B und ISL1/2 bei 19 DDC in mit RA4D + SAG behandelten Kulturen. c Immunzytochemie für Serotonin (5-HT) zusammen mit MAP2, GATA3 oder PHOX2B bei 34 DDC. d Quantifizierung von HuC/D+-Zellen, die PHOX2B, GATA3 oder GATA3 und 5-HT exprimieren, bei 34 DDC (n = 3 unabhängige Differenzierungen). Daten dargestellt als Mittelwert ± SD e Immunzytochemie der angegebenen Marker in 5HTNs bei 35–45 DDC. Maßstabsbalken: 100 µm in Panels (b, c) und 50 µm in Panel (e).

Ein zentrales Ziel der Stammzellforschung ist die Entwicklung einfacher und robuster Differenzierungstechniken, die zu einer reproduzierbaren Produktion des gewünschten Zellprodukts mit hoher Ausbeute und Reinheit führen58. In dieser Studie stellen wir einen alternativen Ansatz zur Ableitung transplantierbarer menschlicher mDA-Neuronen vor, der sich grundsätzlich von bestehenden hochmodernen hPSC-basierten mDA-Neuronenprotokollen unterscheidet, da er zur Durchsetzung die RA-Signalisierung anstelle von CHIR99021 oder CHIR99021 und FGF8 nutzt MB-Identität zu hPSC-abgeleiteten neuronalen Vorläufern. In Kombination mit der Aktivierung des SHH-Signalwegs führt ein 48-stündiger RA-Impuls zu einer konsistenten Spezifikation der vMB-Vorläufer mit vernachlässigbarer Kontamination von Zellen, die dienzephale oder hinterhirnidentische Identitäten exprimieren. RA-spezifische vMB-Vorläufer durchlaufen fortschreitende Differenzierungs- und Reifungsschritte, die mit der normalen Entwicklung von mDA-Neuronen übereinstimmen, was zu einer hohen Ausbeute an mDA-Neuronen führt, die in Langzeitkulturen funktionelle Merkmale exprimieren.

Wir zeigen, dass RA ausreicht, um immer mehr kaudale Gehirnidentitäten durchzusetzen, vergleichbar mit der fortschreitenden Aktivierung der kanonischen WNT-Signalisierung durch CHIR99021. Ein Unterscheidungsmerkmal der RA-basierten Musterung besteht jedoch darin, dass die regionale Spezifikation durch die Dauer der Signalexposition festgelegt wird und dass die Musterungsreaktion relativ unempfindlich gegenüber veränderten RA-Konzentrationen ist. RA unterscheidet sich in diesem Aspekt von den meisten entwicklungsbedingten Morphogensignalen, die bei unterschiedlichen Konzentrationen unterschiedliche Schicksale angeben, einschließlich WNT12,16. Wir könnten die Toleranz gegenüber variablen RA-Eingangspegeln einer negativen Rückkopplungsschleife zuordnen, wodurch Schwankungen des RA-Eingangs durch Anpassung der Änderungen der RA-Umsatzrate durch CYP26A143 ausgeglichen werden. Dieser regulatorische Schaltkreis ist für eine zuverlässige regionale Spezifikation von entscheidender Bedeutung, da die Musterreaktion nach der pharmakologischen Hemmung von CYP26A1 gestört wurde. Dementsprechend sorgen diese Regulierungsmerkmale für Robustheit und Reproduzierbarkeit des Differenzierungsverfahrens und sollten dazu beitragen, die Notwendigkeit von Charge-zu-Charge- und Linie-zu-Linie-Anpassungen zu reduzieren. Dies könnte Differenzierungen erleichtern, wenn mehrere hiPSC-Linien für den klinischen Einsatz oder die Modellierung von Krankheiten in vitro in Betracht gezogen werden2,8, sowie Bemühungen zur Ausweitung, wenn eine große Anzahl von Zellen benötigt wird. Zusätzlich zur Förderung des Schicksals von mDA-Neuronen zeigen wir, dass eine längere RA-Exposition dazu genutzt werden könnte, kraniale MNs und 5HTNs zu produzieren, was auf eine breite Anwendbarkeit des Differenzierungsparadigmas hinweist. Während unsere Studie eindeutig belegt, dass RA ausreicht, um das mesenzephale Schicksal unabhängig von WNT- und FGF8-Signalen zu bestimmen, hat eine frühere Studie eine Kombination aus RA, WNT1, FGF8a und SHH für die hPSC-basierte Ableitung von mDA-Neuronen genutzt59. In dieser Studie wurde in Langzeitkulturen eine Ausbeute von ~1 % FOXA2+/TH+-Neuronen beobachtet, aber FOXA2+/TH+-Neuronen gingen verloren, wenn WNT1 selektiv aus dem Differenzierungsverfahren weggelassen wurde. Die Verwendung von RA in dieser speziellen Situation reichte daher nicht aus, um das Schicksal von mDA-Neuronen zu spezifizieren, und dies konnte stattdessen der WNT-Signalisierung zugeordnet werden.

Wir fanden heraus, dass eine frühe RA-Exposition im Zusammenhang mit der dSMADi-Behandlung auch eine schnelle und schalterartige Umwandlung von OCT4+/SOX1− hPSCs in OCT4−/SOX1+ NSCs fördert. Diese Aktivität hat eine synchronisierende Wirkung auf Zellen auf Populationsebene und erklärt vermutlich, warum RA-spezifische vMB-Vorläufer ca. 2–3 Wochen nach Ende der RA-Behandlung einen relativ koordinierten Übergang von einem FP-Zustand in einen neurogenen Zustand durchlaufen. Die RA-gesteuerte Auflösung der Pluripotenz ist auch aus Sicherheitsgründen wünschenswert, da sie das potenzielle Risiko einer Reaktivierung von Pluripotenzgenen minimiert oder dass sporadische Zellen Pluripotenzmerkmale über längere Zeiträume beibehalten. Vor diesem Hintergrund ist es jedoch wichtig zu betonen, dass es nach umfangreichen präklinischen Bewertungen oder aus eingeleiteten klinischen Experimenten mit früheren mDA-Neuronenprotokollen keine Berichte über unerwünschte Nebenwirkungen wie zelluläres Überwachsen gibt60,61.

Bei der Transplantation in das Striatum von Ratten mit 6-OHDA-Läsionen verpflanzen sich RA-spezifische vMB-Vorläufer, differenzieren sich zu reifen mDA-Neuronen, die langfristig überleben, und stellen die motorische Funktion wieder her. Ein Großteil der in Transplantaten vorhandenen TH+-Neuronen exprimierte EN1, was insbesondere darauf zurückzuführen ist, dass EN1 für das langfristige Überleben von mDA-Neuronen in Mäusen erforderlich ist62,63. Da unsere In-vitro-Analysen eine vernachlässigbare Expression von EN1 in RA-spezifizierten vMB-Vorläufern belegen (Abb. 2e, 4m), haben wir EN1 in dem für die Transplantation verwendeten Präparat nicht untersucht. Wir können daher nicht formal schlussfolgern, dass dieser Charge die EN1-Expression fehlte, was möglicherweise die Anzahl der erzeugten EN1+/TH+-Neuronen beeinflussen könnte. Da jedoch in vitro eine Hochregulierung von EN1 in einer Untergruppe relativ junger mDA-Neuronen beobachtet wird, erscheint es plausibler, dass der hohe Anteil an EN1+/TH+-Neuronen in Transplantaten eine fortschreitende Aktivierung von EN1 in reifenden RA-spezifizierten mDA-Neuronen im Laufe der Zeit widerspiegelt. Die Quantifizierung von SOX6, PITX3 und GIRK2 in Transplantaten zeigt außerdem, dass der Großteil der RA-spezifizierten mDA-Neuronen eine A9-ähnliche Subtypidentität exprimiert. Daher bietet die RA-basierte vMB-Spezifikation einen potenziellen alternativen Weg zur Erzeugung von Zellen für die Zelltherapie bei Parkinson. In dieser ersten Transplantationsstudie isolierten wir vMB-Vorläufer für die Transplantation in einem jungen FP-Zustand, was einen wichtigen Proof-of-Concept lieferte, dass mDA-Neuronen, die mit RA-basierten Protokollen erzeugt wurden, genauso funktionieren wie mDA-Neuronen, die mit CHIR-basierten Protokollen erzeugt wurden13,17,52 ,53.

Da RA-spezifische Zellen eine relativ synchronisierte Differenzierung durchlaufen, wird es in zukünftigen Experimenten spannend sein zu untersuchen, ob die Transplantation von vMB-Vorläufern, die in anderen Reifungsstadien isoliert wurden, möglicherweise den Ertrag, die Funktion und die Innervation von mDA-Neuronen oder die Zusammensetzung der Transplantate verbessern könnte64. Die Identifizierung von RA als MB-Mustermittel stellt darüber hinaus ein zusätzliches Instrument zur Untersuchung dar, ob die kombinatorische Verwendung von Mustersignalen die Qualität von Präparaten verbessern kann, wie bereits für die fortschreitende Entwicklung von CHIR99021/FGF8-basierten mDA-Neuronenprotokollen gezeigt13,17,65. Beispielsweise verwendeten neuere CHIR-Protokolle FGF817 oder einen zweiten CHIR-Boost18, um unerwünschte dienzephale Vorläufer in Präparaten zu reduzieren, indem sie eine kaudale EN1+ vMB-Vorläuferidentität förderten, was das Transplantationsergebnis verbesserte. RA-spezifische Vorläufer erwerben eine EN1−-ähnlichere vMB-Identität ohne nennenswerte Kontamination der Zwischenhirnzellen, was ebenfalls zu einem guten Transplantationsergebnis führte. In diesem Zusammenhang ist bemerkenswert, dass es eine ungleichmäßige topologische Verteilung der mDA-Neuronensubtypen entlang der rostro-kaudalen Achse des adulten MB gibt und dass die A9-Subtypen rostral 51,66 konzentriert sind. Inwieweit dies mit dem Positionsursprung der Geburt von Neuronen zusammenhängt, bleibt ungewiss, aber da RA eine rostralähnliche vMB-Identität vorschreibt, während CHIR und FGF8 eher kaudale vMB-Identitäten fördern17,18, wird es interessant sein, die Frage nach Untermustern zu untersuchen von vMB-Vorläufern durch die kombinatorische Nutzung dieser Signale kann verwendet werden, um die Subtypzusammensetzung von mDA-Neuronen in Transplantaten zu modulieren. Da RA außerdem vor den Signalen wirkt, die vom Isthmus-Organisator ausgehen, ist es denkbar, dass die sequentielle Aktivierung der RA- und WNT-Signalübertragung in hPSC-Kulturen die normale Embryonalentwicklung besser nachahmt, was sowohl hinsichtlich der Ausbeute als auch der funktionellen Effizienz von aus hPSC stammendem mDA von Vorteil sein könnte Neuronen nach der Transplantation.

Menschliche ESC-Linien (HS980 und HS401)67 wurden von Dr. bereitgestellt. Outi Hovatta und Fredrik Lanner (Karolinska Institutet). Menschliche iPSC-Linien (SM55 und SM56) wurden von Drs. Pamela J. McLean und Simon Moussaud (Neuroregeneration Lab im Center for Regenerative Medicine, Mayo Clinic) bereitgestellt. Die Isolierung primärer menschlicher Hautfibroblasten (mit Einwilligung des Patienten gewonnen) und die Erzeugung von iPSCs wurden vom Mayo Clinic Institutional Review Board gemäß IRB-Protokollen (IRB 09-003803) genehmigt. Die Zellen wurden auf mit rekombinantem humanem Vitronektin (VTN) (Thermo Fisher Scientific) beschichteten Platten in iPS-Brew XF-Medium (Miltenyi Biotech) gehalten. Die Zellen wurden mit EDTA (0,5 mM) passagiert und dem Medium wurde in den ersten 24 Stunden nach dem Ausplattieren ein ROCK-Inhibitor in einer Endkonzentration von 10 µM zugesetzt. Alle Zelllinien wurden negativ auf Mykoplasmenkontamination getestet. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Differenzierungen unter Verwendung der hESC-Linie HS980 durchgeführt.

Zur PSC-Differenzierung wurden 80–90 % konfluente PSC-Kulturen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült, 5–7 Minuten lang mit EDTA (0,5 mM in PBS) behandelt und in PBS zu einer Einzelzellsuspension resuspendiert. Die Zellen wurden bei 400 g heruntergeschleudert und in N2B27-Medium (DMEM/F12: Neurobasal (1:1), 0,5 × N2 und 0,5 × B27 (plus Vitamin A) Ergänzungsmittel, 1 × nicht essentielle Aminosäuren, 1 % GlutaMAX, 55 µM) resuspendiert β-Mercaptoethanol – alle von Thermo Fisher Scientific) mit 5 μM SB431542 (Miltenyi Biotech) und 2,5 μM DMH1 (Santa Cruz Biotech) (doppelte SMAD-Hemmung) sowie 10 μM ROCK-Inhibitor (für die ersten 48 Stunden nach der Aussaat). Die Zellen wurden auf einer mit VTN (2 μg/cm2) und Fibronektin (FN) (2 μg/cm2) (Sigma) beschichteten Oberfläche mit einer Dichte von 60.000–80.000 Zellen/cm2 für RA- und RA-Analoga-basierte Experimente und 20.000 Zellen ausgesät /cm2 für CHIR99021-Experimente. SAG1.3 (Santa Cruz Biotechnology), CHIR99021 (Miltenyi Biotech), all-trans RA, 9-cis RA, 13-cis RA, Tazarotensäure, R115866 (alle Sigma), EC23 (Amsbio) wurden in Konzentrationen und Zeitpunkten verwendet im Ergebnisteil beschrieben. All-trans-RA und RA-Analoga wurden in DMSO (10 mM Stammlösung) gelöst, lichtgeschützt aliquotiert und innerhalb eines Monats verwendet. Aliquote wurden bei –20 °C gelagert und einmal verwendet.

Zur mDA-Neuronendifferenzierung (siehe Schema in Abb. 4) wurden neurale Vorläufer bei 9 DDC mit dem Stem Cell Passaging Tool (Thermo Fisher Scientific) mechanisch dissoziiert und im Verhältnis 1:3 in N2B27-Medium mit 10 µM ROCK-Inhibitor ausgesät (für die ersten 48 Stunden). nach Dissoziation) auf VTN- und FN-beschichteten Oberflächen. Zur terminalen In-vitro-Differenzierung dopaminerger Neuronen wurden die Zellen bei 23 oder 24 DDC mit Accutase (Thermo Fisher Scientific) dissoziiert und auf VTN + FN + Laminin (jeweils 2 μg/cm2) (Sigma) ausplattiert (600.000–800.000 Zellen/cm2). Beschichtete Oberfläche in B27+-Medium (Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit BDNF (10 ng/ml) und GDNF (10 ng/ml) (Miltenyi Biotech), Ascorbinsäure (0,2 mM) (Sigma), 10 µM ROCK-Inhibitor (Miltenyi Biotech) (für die ersten 48 Stunden nach der Dissoziation). Für die Analyse der Elektrophysiologie und des Neurotransmittergehalts wurden die Zellen in B27-Elektrophysiologiemedium (Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit BDNF (10 ng/ml) und GDNF (10 ng/ml) (Miltenyi Biotech), Ascorbinsäure (0,2 mM) (Sigma) und gezüchtet 10 µM ROCK-Inhibitor (für die ersten 48 Stunden nach der Dissoziation) für mindestens 5 Tage vor dem Experiment. Das Medium wurde routinemäßig alle 2–3 Tage gewechselt.

Zur MN- und 5HTN-Differenzierung (siehe schematische Zeichnung in Abb. 6) wurden die Zellen in N2B27-Medium mit 5 μM SB431542 und 2,5 μM DMH1 sowie 10 μM ROCK-Inhibitor (für die ersten 48 Stunden nach der Aussaat) resuspendiert und auf VTN + FN ausgesät ( 2 μg/cm2) beschichtete Oberfläche mit einer Dichte von 60.000–80.000 Zellen/cm2. Die Zellen wurden in den ersten vier Tagen mit 200 nM RA oder EC23 behandelt. Den Differenzierungsmedien von 2–9 DDC wurden 200 nM SAG1.3 zugesetzt. Die Kulturen wurden bei 9 DDC mit dem Stem Cell Passaging Tool mechanisch dissoziiert, in N2B27-Medium mit 10 µM ROCK-Inhibitor resuspendiert (für die ersten 48 Stunden nach der Dissoziation) und im Verhältnis 1:3 auf VTN + FN-beschichteten Oberflächen ausgesät. Zur terminalen In-vitro-Differenzierung von 5HTNs wurden die Zellen bei 23 oder 24 DDC mit Accutase dissoziiert und auf einer mit VTN + FN + Laminin (jeweils 2 μg/cm2) beschichteten Oberfläche in B27+-Medium, ergänzt mit 10 ng, ausplattiert (600.000–800.000 Zellen/cm2). /ml BDNF, 10 ng/ml GDNF, 0,2 mM Ascorbinsäure, 10 µM ROCK-Inhibitor (für die ersten 48 Stunden nach der Dissoziation) und 10 µM DAPT. Das Medium wurde routinemäßig alle 2–3 Tage gewechselt.

Die Zellen wurden 12 Minuten lang fixiert. bei Raumtemperatur (RT) in 4 % Paraformaldehyd in PBS, dreimal in PBST (PBS mit 0,1 % Triton-X100) gespült und 1 Stunde lang bei RT mit Blockierungslösung (3 % FCS/0,1 % Triton-X100 in PBS) blockiert ). Die Zellen wurden dann über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern inkubiert, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern bei RT. Sowohl primäre als auch mit Fluorophoren konjugierte sekundäre Antikörper wurden in Blockierungslösung verdünnt. Es wurden geeignete Alexa (488, 555, 647)-konjugierte Sekundärantikörper (Molecular Probes) verwendet. Die Immunhistochemie wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. 17. Die verwendeten primären und sekundären Antikörper sind in der Ergänzungstabelle 4 aufgeführt.

Immunfluoreszenzbilder wurden mit einem konfokalen Zeiss LSM 700-Mikroskop mit ZEN 2011-Software, einem Zeiss AxioImager M2-Fluoreszenzmikroskop mit ZEN2-Software und Molecular Devices ImageXpress Micro (Softwareversion 6.0) aufgenommen und mit dem Open-Source-ImageJ/Fiji (v1.53) analysiert. , CellProfiler (v3.1.5) oder MetaXpress (v 5.0).

Die Gesamt-RNA wurde mit dem Quick-RNA Mini Prep Plus Kit (Zymo Research) isoliert. Die cDNA wurde mit dem Maxima First Strand cDNA-Synthesekit (Thermo Fisher Scientific) hergestellt. Die quantitative Echtzeit-PCR wurde in einem 7500 Fast Real Time PCR-System-Thermocycler unter Verwendung des Fast SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) durchgeführt. Die Analyse der Genexpression wurde mit der 2−ΔΔCt-Methode durchgeführt, wobei die relative Genexpression auf die GAPDH-Transkriptniveaus normalisiert wurde. Die verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt.

Für die Illumina-RNA-Sequenzierung wurde die RNA-Integrität auf einem Agilent RNA 6000 Pico-Chip unter Verwendung des Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies) bestimmt. Für den Bibliotheksaufbau wurde das Illumina TruSeq Stranded mRNA-Kit mit Poly-A-Selektion verwendet. Die Proben wurden auf NovaSeq6000- und HiSeq2500-Instrumenten mit einem 2×51-Setup sequenziert. Die Konvertierung von Bcl zu FastQ wurde mit bcl2fastq_v2.19.1.403 aus der CASAVA-Software-Suite durchgeführt. Lesevorgänge wurden der menschlichen Genomassemblierung zugeordnet, Build GRCh37 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.13/] unter Verwendung von STAR (v 2.6.1a)68. Die Häufigkeiten auf Genebene wurden mithilfe von StringTie269 als FPKMs geschätzt. Die Lesezusammenfassung für jedes Gen (dh die Anzahl) wurde mit featureCounts70 berechnet. Mehrere ENSEMBL-Gen-IDs wurden pro bekanntem HUGO-Gensymbol zusammengefasst. Der Differentialausdruck wurde aus logarithmisch transformierten FPKM-Werten geschätzt. Die statistische Signifikanz des Differentialausdrucks wurde mit dem R-Funktions-t-Test unter Verwendung von p-Werten und der Rate falscher Entdeckungen (R-Paket v. 3.6.2) unter der Annahme ungleicher Varianz und unter Anwendung der walisischen Modifikation der Freiheitsgrade geschätzt. Abhängig vom Versuchsaufbau wurde das Design entweder als gepaart oder als ungepaart betrachtet. Die resultierenden p-Werte der differentiellen Expression wurden von entsprechenden Fold-Change-Werten begleitet. Die p-Werte wurden für mehrere Tests angepasst, indem die Falscherkennungsrate (FDR) nach der Methode von Benjamini und Hochberg71 berechnet wurde.

Das Heatmap-Plotten und die PCA-Visualisierung wurden mit Online-Tools (Beta-Version) unter [https://www.evinet.org/]72 unter Verwendung der Standardparametereinstellungen des R-Pakets „heatmaply“ und der Funktion „princompas“ im Backend durchgeführt.

Die Zellen wurden in RIPA-Puffer (Sigma), ergänzt mit einem Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (ThermoFisher Scientific), lysiert und 30 Minuten lang unter Schütteln auf Eis inkubiert. Das Lysat wurde durch Zentrifugation (20.000 g für 20 Minuten bei 4 °C) geklärt und die Proteinkonzentration wurde durch einen Bicinchoninsäure-Assay (BCA) bestimmt. Proteinlysat wurde in LDS-Puffer (Thermo Fisher Scientific), der 2,5 % 2-Mercaptoethanol enthielt, resuspendiert und 5 Minuten bei 95 °C denaturiert. 15–30 μg Protein wurden pro Spur eines 4–15 % SDS-Polyacrylamidgels (Bio-Rad) geladen und mit dem Trans-Blot Turbo System (BioRad) auf Nitrozellulosemembranen (BioRad) übertragen. Die Membranen wurden in Blockierungslösung (TBS mit 0,1 % Tween-20 (TBST) und 5 % fettfreier Trockenmilch) 1 Stunde lang bei RT inkubiert, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern. Nach drei Wäschen mit TBST bei RT wurden die Membranen 1 Stunde lang bei RT mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern inkubiert. Der Nachweis von HRP erfolgte mit dem Chemilumineszenzsubstrat SuperSignal West Dura und das Signal wurde auf einem ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad) nachgewiesen. Primärantikörper für das Immunblotting sind in der Ergänzungstabelle 4 aufgeführt.

Die Konzentrationen von Noradrenalin (NA), Dopamin (DA) und Serotonin (5-HT) in 42 DDC-Kulturen wurden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit elektrochemischer Detektion bestimmt.

In dSMADi+RA2D differenzierte Kulturen bei 42 DDC wurden in physiologischer Lösung (140 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 1 mM MgCl2; 1,8 mM CaCl2; gepuffert mit HEPES (20 mM) bei pH 7,4) oder in einer Lösung mit hohem K+-Gehalt (physiologische Lösung) inkubiert mit 56 mM K+, und die Konzentration der Na+-Ionen wurde proportional reduziert, um die gleiche Gesamtosmolarität beizubehalten). Nach 20 Minuten (Min.) wurden Inkubationslösungen gesammelt und zur Analyse des Neurotransmittergehalts verwendet. Um den zellulären Neurotransmittergehalt zu bestimmen, wurden die Zellen in H2O lysiert. Inkubationslösungen und Zelllysate wurden mit 0,1 M Perchlorsäure deproteinisiert und nach 15 min. Nach Inkubation auf Eis wurden die Proben 15 Minuten lang bei 20.000 g doppelt zentrifugiert. wie zuvor beschrieben73. Die Proteinkonzentration wurde mit der BCA-Methode bestimmt. Die Proben wurden dann in einem HPLC-System analysiert, das aus HTEC500 (Eicom, Kyoto, Japan) und einem CMA/200 Refrigerated Microsampler (CMA Microdialysis, Stockholm, Schweden) bestand, das mit einer 20-μl-Schleife ausgestattet war und bei +4 °C betrieben wurde. Das Potential der Glaskohlenstoff-Arbeitselektrode betrug + 450 mV gegenüber der Ag/AgCl-Referenzelektrode. Die Trennung wurde auf einer 200 × 2,0 mm Eicompak CAX-Säule (Eicom) erreicht. Die mobile Phase war eine Mischung aus Methanol und 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0) (30:70, Vol./Vol.), die 40 mM Kaliumchlorid und 0,13 mM EDTA-2Na enthielt. Die Chromatogramme wurden mit dem computergestützten Datenerfassungssystem Clarity (DataApex) aufgezeichnet und integriert.

Die durchschnittliche Neuritenlänge wurde mit dem NeuronJ-Plugin im ImageJ-Paket74 [https://imagej.net/plugins/neuronj] auf Immunfluoreszenzbildern von TH+-Neuronen quantifiziert (10-fache Vergrößerung, 0,5-Zoom). Die Anzahl der Verzweigungen pro Neuron wurde anhand von Immunfluoreszenzbildern von TH+-Neuronen bei höherer Vergrößerung, 20-fach, berechnet.

Objektträger mit 35–60 Tage alten Neuronen wurden in eine Aufzeichnungskammer mit elektrophysiologischem Medium (Neurabasal Medium, Electro; Thermo Fisher Scientific) gelegt. Zur Aufzeichnung wurden Neuronen mit einem DIC-Mikroskop (Scientifica, Uckfield, UK) mit einem 60-fach-Objektiv (Olympus, Tokio, Japan) sichtbar gemacht. Patchpipetten (Widerstand 3–5 MΩ für Spannungsklemmenaufzeichnungen, 5–10 MΩ für Stromklemmenaufzeichnungen), die an einem P-87 Flaming/Brown-Mikropipettenzieher (Sutter Instruments, Novato, CA, USA) gezogen wurden, wurden mit entweder 154 gefüllt mM NaCl-Lösung für Spannungsklemmenaufzeichnungen oder 120 mM KCl-Lösung mit 8 mM Biocytin für Stromklemmenaufzeichnungen. Die Signale wurden mit einem Axon MultiCalmp 700B-Verstärker aufgezeichnet und mit einem Axon Digidata 1550B-Digitalisierer (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) bei 20 kHz digitalisiert. Zugangswiderstand und Pipettenkapazität wurden kompensiert. Aufzeichnungen der an die Zelle angeschlossenen Spannungsklemmen wurden bei 2 Hz niedrig/1 kHz hoch bandpassgefiltert und Ereignisse, die eine Hyperpolarisation zeigten, wurden als spontane Aktionspotentiale betrachtet. Um Spike-Muster zu beurteilen, wurden im Current-Clamp-Modus aufgezeichnete Neuronen auf einem Membranpotential von –60 mV gehalten. Zur Bestimmung des Rheobase-Stroms wurden Stromschritte nahe der Schwelle angewendet, anschließend wurden 1-s-Stromschritte proportional zum Rheobase-Strom angewendet. Das Vorhandensein von Na+- und K+-Strömen wurde im Spannungsklemmenmodus durch Anlegen eines Spannungsschritts mit Intervallen von 10 mV ausgehend von einem Haltewert von –60 mV bestimmt. Die Ströme wurden von der Grundlinie (10 ms vor Beginn des Spannungsschritts) bis zum Höhepunkt der charakteristischen schnellen Na+-Stromkomponente oder dem Höhepunkt der langsamen K+-Stromkomponente gemessen. Die elektrischen Eigenschaften wurden mit einem speziell geschriebenen Matlab-Skript (MathWorks, Natick, MA, USA) [https://zenodo.org/record/6367837#.YjSC3DUo9PY] extrahiert. Nach der Aufnahme wurden die Objektträger wie oben beschrieben fixiert, gefärbt und abgebildet. Biocytin wurde mit Streptavidin Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific) sichtbar gemacht.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Richtlinie der Europäischen Union (2010/63/EU) durchgeführt und von der Malmö/Lund-Ethikkommission für die Verwendung von Labortieren (Malmö/Lunds djurförsöksetiska nämnd) und dem schwedischen Landwirtschaftsministerium (Jordbruksverket) genehmigt ). Erwachsene weibliche, athymische „nackte“ Ratten wurden von Harlan/Envigo Laboratories (Hsd:RH-Foxn1rnu) gekauft und mit ad libitum Zugang zu Futter und Wasser in einem 12-Stunden-Licht/Dunkel-Zyklus gehalten. Die Tiere waren zu Beginn des Experiments mindestens 16 Wochen alt (180 g). Chirurgische Eingriffe und Läsionen der nigrostriatalen Bahn durch eine einzelne einseitige Injektion von 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) in das rechte mediale Vorderhirnbündel (MFB) wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt75. Kurz gesagt, chirurgische Eingriffe wurden unter Vollnarkose unter Verwendung einer Lösung aus Fentanyl und Medetomidin (20:1) durchgeführt, die intraperitoneal injiziert wurde (1 ml/kg; Apoteksbolaget, Schweden). Die Läsion des nigrostriatalen Signalwegs bei „nackten“ Ratten wurde durch einseitige Injektion von 6-Hydroxydopamin in den rechten MFB mit einem Volumen von 4 µL bei einer Freebase-Konzentration von 3,5 mg/ml zu den folgenden Koordinaten relativ zu Bregma induziert: A/P − 4; M/L −1,2; D/V (von Dura) −7,5. Der Schweregrad der Läsion wurde vier Wochen nach der 6-OHDA-Injektion durch amphetamininduzierte Rotationen gemessen, die über einen Zeitraum von 90 Minuten mit einem automatisierten System (Omnitech Electronics)17 aufgezeichnet wurden, und durch einen Schritttest13. Die durch Amphetamin induzierte Rotation wurde durch intraperitoneale Injektion von 2,5 mg/kg Amphetaminhydrochlorid (Sigma) induziert. Acht Wochen nach der 6-OHDA-MFB-Läsion erhielten „nackte“ Ratten am 14. Tag der Differenzierung in das Striatum eine Gesamtdosis von 150.000 hESC-abgeleiteten Vorläufern, wie zuvor beschrieben75. Kurz gesagt wurde ein Volumen von 2 µL Zellsuspension (Zellen mit einer Konzentration von 75.000 Zellen/µL wurden mit einer Geschwindigkeit von 1 µL pro Minute injiziert, gefolgt von einer Diffusionszeit von 2 Minuten) an den folgenden Koordinaten relativ zum Bregma in das Striatum injiziert : A/P + 0,5; M/L −3; D/V (von Dura) −4,5; auf Flachkopf eingestellt. Der Amphetamin-induzierte Rotations- und Schritttest wurde 7 Monate nach der Transplantation beurteilt. Die Tiere wurden nach einer Verhaltensanalyse perfundiert und dann für die Immunhistochemie verarbeitet.

Die P-Werte wurden mithilfe des Student-T-Tests, des Welch-T-Tests mit ungleicher Varianz oder des paarweisen Wilcoxon-Tests berechnet und zur statistischen Analyse zweier Gruppen durchgeführt. Die verwendeten statistischen Methoden sind in den jeweiligen Abbildungslegenden angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Quelldaten für Abb. 1–6 und ergänzende Abbildungen. 1–7 liegen diesem Papier bei. Die in diesem Manuskript beschriebenen RNA-seq-Datensätze wurden beim Gene Expression Omnibus unter der Zugangsnummer GSE147404 hinterlegt. Assemblierung des menschlichen Genoms, Build GRCh37 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.13/].

Skripte und Daten zur Analyse der elektrischen Eigenschaften von Neuronen sind unter [https://zenodo.org/record/6367837#.YjSC3DUo9PY] verfügbar.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Dr. Outi Hovatta und Fredrik Lanner (Karolinska Institutet) für hESC-Linien, Drs. Pamela J. McLean und Simon Moussaud, Neuroregeneration Lab im Center for Regenerative Medicine, Mayo Clinic (Mayo Clinic, Jacksonville) für hiPSC-Linien. Wir danken der National Genomics Infrastructure in Genomics Production, Stockholm, für ihre Unterstützung bei der massiv parallelen Sequenzierung und den Zugang zur UPPMAX-Recheninfrastruktur. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Knut and Alice Wallenberg Foundation (KAW2011.0661, KAW2012.0101; JE), des Swedish Research Council (2013-4155, 2017-02089; JE) und der Swedish Foundation for Strategic Research (SRL10-0030; JE) unterstützt. JE), Hjärnfonden (FO2017-0037, F02019-0154, F02021-0159; JE), Parkinson Fonden (1189/19, 1257/20, 1326/21; JE), Novo Nordisk Foundation (NNF20OC0062355; JE), Karolinska Institutet ( JE).

Open-Access-Förderung durch das Karolinska-Institut.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: José M. Dias, Andrew F. Adler, Mariya Kozhevnikova.

Abteilung für Zell- und Molekularbiologie, Karolinska Institutet, 171 65, Stockholm, Schweden

Zhanna Alekseenko, José M. Dias, Mariya Kozhevnikova, Ashwini Jeggari, Svitlana Vasylovska und Johan Ericson

Entwicklungs- und regenerative Neurobiologie, Abteilung für experimentelle medizinische Wissenschaft, Wallenberg Neuroscience Center, Universität Lund, 221 84, Lund, Schweden

Andrew F. Adler, Sara Nolbrant und Malin Parmar

Lund Stem Cell Center, Universität Lund, 22184, Lund, Schweden

Andrew F. Adler, Sara Nolbrant und Malin Parmar

Abteilung für Biowissenschaften und Ernährung, Karolinska Institutet, 141 83, Huddinge, Schweden

Josina Anna van Lunteren & Marie Carlén

Abteilung für Physiologie und Pharmakologie, Karolinska Institutet, 171 65, Stockholm, Schweden

Takashi Yoshitake & Jan Kehr

Pronexus Analytical AB, Bromma, Schweden

Jan Kehr

Abteilung für Neurowissenschaften, Karolinska Institutet, 171 65, Stockholm, Schweden

Marie Carlén

Abteilung für Mikrobiologie, Tumor- und Zellbiologie, Karolinska Institutet, 171 65, Stockholm, Schweden

Andrej Alexejenko

Science for Life Laboratory, 171 21, Solna, Schweden

Andrej Alexejenko

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ZA: Konzeption und Studiendesign, hPSC-Differenzierung und -Charakterisierung, Datenanalyse und -interpretation. JMD und MK: hPSC-Manipulation, Differenzierung und Charakterisierung, Dateninterpretation. AFA: In-vivo-Transplantation, Verhaltensanalysen, Transplantationsdatenanalyse mit Beitrag von SNJAvL und MC: Elektrophysiologie und Datenanalyse. AJ und AA: RNA-seq-Datenanalyse und Bioinformatik. SV: hPSC-Differenzierung und -Charakterisierung. JK und TY: HPLC-Analyse. MP-Design und Überwachung von Transplantationsstudien. JE: Betreuung, Konzeption und Studiendesign sowie Manuskripterstellung gemeinsam mit ZA, JMD, AFA und MP

Korrespondenz mit Johan Ericson.

Eine Patentanmeldung (Nr. 2006792.2) zu den in der Arbeit vorgestellten Ergebnissen wurde von JE und ZA mit Unterstützung von Karolinska Institute Innovations AB eingereicht. MP ist Eigentümer von Parmar Cells AB und Miterfinder der folgenden Patente WO2016162747A2, WO2018206798A1 und WO2019016113A1. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Alekseenko, Z., Dias, JM, Adler, AF et al. Robuste Ableitung transplantierbarer Dopamin-Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen durch zeitgesteuerte Retinsäureabgabe. Nat Commun 13, 3046 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30777-8

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Eingegangen: 01. Februar 2021

Angenommen: 11. Mai 2022

Veröffentlicht: 01. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30777-8

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