Präfrontale Projektionen auf den Nucleus reuniens signalisieren die Verhaltensrelevanz von Reizen beim assoziativen Lernen

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 11995 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Der Nucleus reuniens (RE) ist für Erinnerungen notwendig, die von der Interaktion zwischen dem medialen präfrontalen Kortex (mPFC) und dem Hippocampus (HPC) abhängig sind. Ein Beispiel ist die Trace-Eyeblink-Konditionierung, bei der der mPFC je nach Kontingenz mit einem aversiven unbedingten Reiz (US) eine unterschiedliche Aktivität gegenüber neutralen konditionierten Reizen (CS) zeigt. Um zu testen, ob dieses Relevanzsignal zum RE weitergeleitet wird, haben wir mPFC-Axonterminals innerhalb des RE photometrisch aufgezeichnet und ihre Veränderungen durch Lernen verfolgt. Zum Vergleich haben wir die präfrontale terminale Aktivität im mediodorsalen Thalamus (MD) gemessen, der keine Verbindung zum HPC aufweist. Bei naiven männlichen Ratten wurden die präfrontalen Terminals innerhalb des RE durch Ton oder Licht nicht stark aktiviert. Da die Ratten einen der Reize (CS+) mit dem US assoziierten, steigerten die Terminals allmählich ihre Reaktion auf den CS+, nicht jedoch auf den anderen Reiz (CS-). Im Gegensatz dazu waren die durch Reize hervorgerufenen Reaktionen der präfrontalen Terminals innerhalb des MD bereits vor der Konditionierung stark. Außerdem wurden sie in der ersten Konditionierungssitzung nur auf CS+ gesteigert; Allerdings verbesserte sich der Grad der Aktivitätsdifferenzierung mit dem Lernen nicht. Diese Ergebnisse legen nahe, dass assoziatives Lernen die mPFC-Ausgabe an den RE selektiv steigerte, was die Verhaltensrelevanz sensorischer Reize signalisiert.

Die Fähigkeit, Zusammenhänge zwischen Umwelteinflüssen und herausragenden Ergebnissen herzustellen, ist ein entscheidender kognitiver Prozess, auf den Organismen angewiesen sind, um sich anzupassen und zu überleben. Dieser assoziative Lernprozess wird häufig anhand klassischer Konditionierungsparadigmen untersucht. Insbesondere testet die Trace Eyeblink Conditioning (TEBC) die Fähigkeit des Probanden, einen neutralen sensorischen Reiz (bekannt als konditionierter Reiz [CS]) mit einem leicht aversiven Augenlidschock (bekannt als unkonditionierter Reiz [US]) zu assoziieren, der nach einem präsentiert wird kurzes Zeitintervall (bekannt als Trace-Intervall). Die Einbeziehung dieser zeitlichen Verzögerung erfordert folglich die Integrität der Vorderhirnregionen, einschließlich des Hippocampus (HPC)1,2,3 und des medialen präfrontalen Kortex (mPFC)4,5,6,7 zusätzlich zu den motorischen Schaltkreisen im Kleinhirn und Hirnstamm8 ,9. Darüber hinaus geht die Bildung dieser CS-US-Reizassoziationen mit der Entwicklung selektiver Feuermuster für die Assoziationen im dorsalen HPC10,11 und mPFC12,13,14,15 einher. Darüber hinaus entwickelte der mPFC mit zunehmendem Lernen eine stärkere durch Reize hervorgerufene Theta- und Gammaband-Oszillationsaktivität16,17,18. Darüber hinaus wird die Aktivität der mPFC-Theta-Bande zeitlich mit der Aktivität der HPC-Theta-Bande gekoppelt19. Zusammenfassend legen diese Ergebnisse nahe, dass eine enge Interaktion zwischen mPFC und HPC für die Bildung von Reizassoziationen bei TEBC von wesentlicher Bedeutung ist.

Es gibt mehrere anatomische Pfade, die die mPFC-HPC-Interaktion unterstützen können. Obwohl monosynaptische Projektionen vom ventralen HPC zum mPFC ausgehen, fehlen dem mPFC monosynaptische erregende Projektionen zurück zum HPC20,21. Stattdessen kann der mPFC die neuronale HPC-Aktivität über mehrere multisynaptische Pfade beeinflussen, an denen Zwischenstrukturen beteiligt sind. Es wird angenommen, dass der Nucleus reuniens des Mittellinien-Thalamus (RE) eine dieser Zwischenregionen ist22,23,24, da er über reziproke anatomische Verbindungen mit dem mPFC und HPC25,26,27 verfügt. Frühere Studien haben gezeigt, dass RE maßgeblich zur Unterstützung der mPFC-HPC-Synchronizität28,29,30 und der Leistung bei Aufgaben beiträgt, die eine mPFC-HPC-Interaktion erfordern, wie z. B. passive Vermeidung31, räumliche Navigation32,33, räumliche Arbeitsgedächtnisaufgaben28,34, kontextuelle Angstkonditionierung35, 36,37,38 und Sequenzspeicheraufgaben39. Insbesondere die Bildung von Reizassoziationen bei TEBC wurde durch hochfrequente elektrische Stimulation des RE während der ersten beiden Tage der Konditionierung bei Mäusen beeinträchtigt40.

Obwohl die oben genannten Beweise die Notwendigkeit des RE für die Erleichterung der mPFC-HPC-Interaktion unterstützen, die verschiedenen Formen kognitiver Prozesse zugrunde liegt, bleibt unbekannt, welche Art von Informationen innerhalb des mPFC-RE-HPC-Signalwegs übertragen werden und insbesondere in welchem ​​Ausmaß welche mPFC-Ausgabe mit den relationalen und physikalischen Merkmalen eines Reizes zusammenhängt. Um diesen Punkt anzugehen, führten wir photometrische Aufzeichnungen der Kalziumdynamik in Axonen von mPFC-Neuronen durch, die innerhalb des RE enden, während Ratten TEBC unterzogen wurden. Die Verwendung von TEBC ermöglicht eine präzise Kontrolle über den Zeitpunkt und die Kontingenz von Reizen und ermöglicht es uns, die Aktivitätsmuster selektiv für sensorische und relationale Reizmerkmale sowie deren Korrelation mit der Aufgabenleistung zu unterscheiden. Zum Vergleich untersuchten wir die lernbedingten Veränderungen in der Aktivität von mPFC-Axonen, die im medialen dorsalen Thalamus (MD) enden. Der MD ist aufgrund seiner Projektionsspezifität eine ideale Kontrolle, da er starke monosynaptische Projektionen vom mPFC41,42,43 empfängt, aber nicht zum HPC44,45 projiziert. Wir fanden heraus, dass präfrontale Ausgänge an RE und MD selektiv für Reizassoziationen waren; Allerdings steigerte nur ersteres seine Selektivität durch Lernen.

Insgesamt 40 männliche Long-Evans-Ratten (Charles River Laboratories), die bei ihrer Ankunft 77 Tage alt waren, wurden einzeln in transparenten Plastikkäfigen in einem Heimkolonieraum gehalten und in einem 12-stündigen umgekehrten Hell-/Dunkel-Zyklus gehalten (Dunkel von 10: 00 bis 22:00 Uhr) mit freiem Zugang zu Essen und Wasser. Ihr Gewicht lag drei Wochen nach ihrer Ankunft zwischen 375 und 410 g. Die Gründe für die Verwendung nur männlicher Ratten waren: (1) Geschlechtsunterschiede in der Lernfähigkeit der Lidschlagkonditionierung aufgrund von Eierstockhormonen46 und (2) frühere Studien zur Untersuchung der mPFC-Funktion und -Aktivität bei TEBC wurden ausschließlich mit männlichen Ratten durchgeführt7,12,16, 17. Während des Dunkelzyklus wurden Verhaltensexperimente durchgeführt. Insgesamt wurden 22 Ratten in Experiment 1 (pharmakologische Inaktivierung des RE) und 18 Ratten in Experiment 2 (Photometrie) verwendet. In Experiment 1 wurden fünf Ratten aufgrund einer falsch ausgerichteten Kanüle entfernt, so dass 17 Ratten für die Analyse der Verhaltensdaten übrig blieben. In Experiment 2 wurden vier Ratten aufgrund falsch ausgerichteter optischer Fasern und eine Ratte aufgrund eines Bruchs des inneren Faserkerns während der Verhaltenskonditionierung entfernt. Somit blieben insgesamt 13 Ratten für die Verhaltens- und photometrische Datenanalyse übrig. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals (Veröffentlichung Nr. 85–23, überarbeitet 1985), dem Canadian Council on Animal's Care, dem APA-Ethikstandard und den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt und von genehmigt das Animal Care Committee der University of Toronto (AUP20011400).

Die in Experiment 1 verwendeten Ratten wurden einem chirurgischen Eingriff unterzogen, bei dem eine Infusionskanüle und Augendrähte implantiert wurden. Die in Experiment 2 verwendeten Ratten wurden zwei chirurgischen Eingriffen unterzogen: zunächst einer viralen Vektorinfusionsoperation, gefolgt von einer optischen Faser- und Augendrahtimplantation.

Drei Wochen nach ihrer Ankunft in der Einrichtung wurden die Ratten in Experiment 2 anästhesiert (2,0–2,5 Vol.-% Isofluran in Sauerstoff bei einer Flussrate von 0,8 l/min; Halocarbon Laboratories) und in einen stereotaktischen Rahmen gebracht. Die Haut und das Gewebe über dem Schädel wurden zurückgezogen und in beide Hemisphären über dem mPFC wurde ein Loch gebohrt. Eine 30G-Infusionsnadel aus rostfreiem Stahl, die über einen Polyethylenschlauch mit einer Mikrospritze (Hamilton) verbunden war, wurde verwendet, um AAV9.CAG.GCaMP6f.WPRE.SV40 (Addgene) an diesen Koordinaten zu verabreichen: anteroposterior (AP) = + 2,7, mediolateral (ML) = ± 0,55, dorsoventral (DV) = − 3,9 mm vom Bregma. Der virale Vektor (0,75 μl/Hemisphäre) wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,1 μl/min injiziert. Die Nadel wurde nach Abschluss der Injektion fünf Minuten lang an Ort und Stelle belassen, anschließend wurde sie auf DV = –3,7 mm zurückgezogen und dort weitere fünf Minuten belassen, um eine erfolgreiche Diffusion des Vektors sicherzustellen. Anschließend wurde die Nadel langsam zurückgezogen und der Einschnitt vernäht. Die Ratten wurden nach der Operation 48 Stunden lang mit einem Analgetikum (Carprofen, 5 mg/kg, subkutan) behandelt. Die Ratten wurden nach der Operation zwei Monate lang in ihrem Heimkäfig gehalten, um die Inkubation und Expression des Virus zu ermöglichen.

Für Experiment 1 wurden die Ratten fünf Wochen nach ihrer Ankunft in der Einrichtung mit Isofluran betäubt und in einen stereotaktischen Rahmen gebracht. Die Haut und das Gewebe über dem Schädel wurden zurückgezogen und über dem RE in der rechten Hemisphäre ein Loch gebohrt (AP = − 2,1, ML = + 2,0 mm vom Bregma). Eine Führungskanüle (Plastics One) wurde durch das auf den RE gerichtete Loch abgesenkt und mit einem Blindmandrin verschlossen (AP = − 2,1, ML = + 2,0, DV = − 6,5 mm vom Bregma in einem 15°-Winkel auf der Mittellinie). Die Kanüle wurde mit rostfreien Schrauben und Dentalacryl am Schädel befestigt. Die zur Verabreichung von Medikamenten verwendete Infusionskanüle ragte 1 mm über die Spitze der Führungskanüle hinaus. Vier teflonbeschichtete Edelstahldrähte, die an einer Anschlusskappe (Plastics One) befestigt waren, wurden subkutan in den oberen linken Augenlidmuskel (Orbicularis oculi) implantiert, um die Aktivität des Elektromyogramms (EMG) aufzuzeichnen und einen periorbitalen Schock abzugeben. Am rechten Scheitelknochen wurde eine Erdungsschraube aus Edelstahl angebracht und mit der Verbindungskappe verbunden. Die Anschlusskappe und die Erdungsschraube wurden mit Edelstahlschrauben und Dentalacryl am Schädel befestigt. Die Ratten wurden nach der Operation 48 Stunden lang mit einem Analgetikum (Carprofen, 5 mg/kg, subkutan) behandelt und zur Genesung eine Woche lang in ihrem Heimkäfig belassen.

Für Experiment 2 wurden die Ratten nach der viralen Inkubation mit Isofluran betäubt und in einen stereotaktischen Rahmen gebracht. Die Haut über dem Schädel wurde zurückgezogen und es wurden bilateral Löcher entweder über dem RE (AP = − 2,1, ML = ± 2,0 mm vom Bregma) oder MD (AP = − 2,6, ML = ± 2,1 mm vom Bregma) gebohrt. An Edelstahlhülsen (Ø 2,5 mm, Thorlabs) gebundene optische Fasern (NA 0,48, Kerngröße 400 µm, FP400URT, Thorlabs) wurden implantiert, um entweder auf den RE (AP = – 2,1, ML = ± 2,0, DV = – 7,3) abzuzielen mm von Bregma in einem Winkel von 15°) oder MD (AP = − 2,6, ML = ± 2,1, DV = − 6,35 mm von Bregma in einem Winkel von 15°). Die optischen Fasern wurden mit Edelstahlschrauben und Zahnacryl am Schädel befestigt. Anschließend wurden die Glasfasern mit einer Staubschutzkappe (Thorlabs) abgedeckt. Anschließend wurde die Anschlusskappe mit ihren vier Augendrähten und einer Erdungsschraube nach dem gleichen Protokoll wie in Experiment 1 installiert. Die chirurgische Versorgung nach der Implantation war identisch mit der in Experiment 1.

In Experiment 1 erstreckte sich das Verhaltensparadigma über insgesamt 12 Tage. Die ersten beiden Tage beinhalteten die Gewöhnung der Ratten an die Konditionierungskammer und die Verfahren, während die folgenden 10 Tage das Training in Version eins eines differenziellen Paradigmas der Spuren-Augenzwinker-Konditionierung (DTEBC1) beinhalteten. Während der Gewöhnungstage (H1 bis H2) wurden die Ratten 50 Minuten lang in einem zylindrischen Kunststoffbehälter (21 cm Durchmesser) untergebracht, der in einer schall- und lichtdämpfenden Kammer ohne jegliche Reize untergebracht war. Ab dem dritten Tag wurden die Ratten einer DTEBC1 unterzogen, wobei ihnen zwei verschiedene Versuchstypen präsentiert wurden. Im ersten Versuchstyp wurde ein tonkonditionierter Reiz (TCS+, 100 ms, 2,5 kHz, 85 dB) mit einem milden Augenlidschock (unkonditionierter Reiz [US], 100 ms, 100 Hz) gepaart, getrennt durch einen 500 ms langen Reiz -freies Intervall. Im zweiten Versuchstyp wurde ein lichtkonditionierter Reiz (LCS-, 100 ms, 50 Hz) allein präsentiert. Obwohl wir die Reize in Experiment 1 nicht ausgeglichen haben, haben wir mit Experiment 2 bestätigt, dass Ratten den Ton und das Licht vergleichbar mit den USA assoziieren, unabhängig davon, welcher der beiden Reize mit den USA gepaart war. Tägliche Konditionierungssitzungen bestanden aus insgesamt 100 Versuchen, wobei jeder Versuch eine 50-prozentige Chance hatte, entweder ein TCS+-Versuch oder ein LCS--Versuch zu sein. Die Präsentation des Versuchstyps erfolgte nach dem Zufallsprinzip, sodass die Ratte nicht wusste, welcher Versuch als nächstes präsentiert werden würde. Die Intervalle zwischen den Versuchen lagen pseudorandomisiert zwischen 20 und 40 Sekunden mit einem Mittelwert von 30 Sekunden. Jede Konditionierungssitzung dauerte etwa 50 Minuten.

Der Zeitpunkt und die Abgabe des Stimulus wurden von einem Mikrocomputer (Arduino Mega, Arduino) gesteuert. Der Tonreiz wurde über einen an der Decke montierten Lautsprecher in der Kammer präsentiert, der Lichtreiz wurde über eine LED präsentiert, die auf Augenhöhe an der Seite der Kammer installiert war, und der US-Stimulus wurde über implantierte Augendrähte an das Augenlid abgegeben angetrieben durch einen Reizisolator (ISO-Flex, AMPI). Der US-Schockpegel wurde ursprünglich auf 0,3 mA eingestellt und für jede Ratte individuell angepasst, um die unbedingte Reaktion (einen Augenzwinkern/eine Kopfdrehung) auszulösen, die durch in den Kammern angebrachte Infrarotkameras überwacht wurde.

Die konditionierte Reaktion (CR) wurde als Augenblinzelreaktion definiert, die während eines 200-ms-Fensters unmittelbar vor dem US-Einsatz ausgelöst wurde. Dasselbe Zeitfenster wurde in Studien genutzt, in denen die USA abwesend waren. Die oben genannten Parameter wurden auf der Grundlage unserer früheren Arbeit ausgewählt, die zeigte, dass Ratten über 10 Sitzungen hinweg den Anteil der Versuche, in denen sie einen CR18,19 exprimierten, stetig erhöhten. Die Augenblinzelreaktionen wurden durch Aufzeichnung der EMG-Aktivität des linken oberen Orbicularis oculi-Muskels über zwei chirurgisch implantierte Edelstahldrähte überwacht. Die EMG-Aktivität wurde zwischen 0,3 und 3,0 kHz bandpassgefiltert, bei 6.102 Hz digitalisiert und mit einem RZ-5-Aufzeichnungssystem (Tucker-Davis Technologies) gespeichert.

In Experiment 2 erstreckte sich das Verhaltensparadigma über insgesamt 13 Tage. In den ersten beiden Tagen wurden die Ratten an die Konditionierungskammer und die Verfahren gewöhnt, am dritten Tag wurden naive Stimulus-Reaktionstests durchgeführt und in den folgenden zehn Tagen wurde Version zwei eines differenziellen Paradigmas der Spuren-Augenzwinker-Konditionierung (DTEBC2) trainiert. Die Gewöhnungstage eins und zwei waren identisch mit denen in Experiment 1, außer dass die Dauer jeder Sitzung 75 Minuten betrug. Am dritten Tag (Sitzung 0) wurden die Ratten für naive Reizreaktionstests in ihre Konditionierungskammern gebracht. Den Ratten wurden drei Versuchstypen präsentiert: Typ eins beinhaltete die Präsentation eines neutralen Tonreizes (TS) allein, Typ zwei beinhaltete die Präsentation eines neutralen Lichtreizes (LS) allein und Typ drei beinhaltete die Präsentation des US durch selbst. Sitzung 0 bestand aus insgesamt 150 Versuchen, wobei jedem Typ 50 Versuche zugeordnet waren. Ab Tag vier (Sitzungen eins bis zehn) wurden die Ratten DTEBC2 unterzogen, wobei sie entweder in tonverstärkter (fünf RE- und fünf MD-Ratten) oder leichtverstärkter (eine RE- und zwei MD-Ratten) Konditionierung trainiert wurden. Bei der tonverstärkten Konditionierung wurden Ratten mit drei verschiedenen Versuchstypen konfrontiert. Im ersten Versuchstyp wurde ein neutraler Tonreiz mit den USA gepaart, getrennt durch ein reizfreies Intervall von 500 ms (konditionierter Reiz plus und US [CS+US]). Im zweiten Versuchstyp wurde der gleiche Tonreiz allein dargeboten (konditionierter Reiz plus [CS+]). Im dritten Versuchstyp wurde ein neutraler Lichtreiz allein präsentiert (konditionierter Reiz minus [CS-]). Ratten, die auf leichte, verstärkte Konditionierung trainiert wurden, hatten in ähnlicher Weise drei Versuchstypen; Allerdings wurden die Stimulusidentitäten vertauscht, so dass CS+US-Studien nun das Licht mit dem Schock kombinierten, die CS+-Studien nur das Licht präsentierten und die CS--Studien nur den Ton präsentierten. Tägliche Konditionierungssitzungen bestanden aus insgesamt 150 Versuchen, CS+US-Versuche traten mit einer Wahrscheinlichkeit von 68 % auf, während CS+- und CS--Versuche jeweils mit einer Wahrscheinlichkeit von 16 % auftraten. Bei Sitzung 0 und den Sitzungen 1 bis 10 dauerte jede Sitzung etwa 75 Minuten. Die Intervalle zwischen den Versuchen und die Randomisierung der Versuchstypen waren ähnlich wie bei Experiment 1.

Die Einbeziehung von CS-Studien allein ermöglichte es uns, die photometrische Signaländerung zu untersuchen, die ausschließlich durch CS hervorgerufen wurde, ohne dass eine Kontamination durch die durch US hervorgerufene Signaländerung erfolgte. Dies ermöglichte es uns, die Veränderung der durch CS hervorgerufenen Aktivität besser zu messen, wenn Ratten unterschiedliche Reizassoziationen bildeten.

Alle Analysen wurden mit benutzerdefiniertem Code durchgeführt, der in MATLAB (Version 2021a, Mathworks)18,19 geschrieben wurde. Für jede Sitzung pro Ratte wurde die Amplitude des EMG-Signals während jedes 1-ms-Zeitintervalls berechnet, indem das minimale Signal vom maximalen Signal während dieses Intervalls subtrahiert wurde. Die EMG-Amplitude wurde während eines 300-ms-Fensters vor Beginn der CS in jedem Versuch gemittelt. Die Basislinie wurde als Median der gemittelten EMG-Amplitude plus einer Standardabweichung festgelegt. Die über dem Schwellenwert liegende EMG-Aktivität wurde während des Zeitraums von 300 ms vor Beginn des CS (Vorwert) und während eines 200 ms-Fensters vor Beginn des US (CR-Wert) gemittelt. Der CR-Wert wurde entwickelt, um die adaptiven Blinzelreaktionen zu erfassen, die unmittelbar vor US-Einsatz auftreten. Ein Versuch wurde als CR-Versuch definiert, wenn der CR-Wert mindestens fünfmal höher war als der Vorwert. Studien, bei denen der Vorwert 30 % des Schwellenwerts überschritt, wurden als „hyperaktive“ Studien klassifiziert und verworfen. Der Prozentsatz der konditionierten Antworten (CR%) in jedem Versuchstyp war die Anzahl der CR-Versuche für diesen Versuchstyp geteilt durch die Gesamtzahl der gültigen Versuche für diesen Typ. Der Prozentsatz der hyperaktiven Versuche wurde berechnet, indem die Gesamtzahl der als hyperaktiv eingestuften Versuche durch die Gesamtzahl der Versuche dividiert wurde (Experiment 1: # hyperaktiv/100, Experiment 2: # hyperaktiv/150). Um das zeitliche Muster der EMG-Aktivität an bestimmten Tagen visuell darzustellen, wurde die EMG-Amplitude in jedem Versuch zunächst durch Division mit dem Vorwert normalisiert. Die normalisierte EMG-Amplitude für diesen Versuch wurde dann über alle gültigen Versuche desselben Versuchstyps bei jeder Ratte und dann über Ratten für bestimmte Tage gemittelt. Für Experiment 1 untersuchten wir das zeitliche Muster der EMG-Aktivität, indem wir die Latenzzeit bis zum Einsetzen der CR sowie die Latenzzeit bis zum Höhepunkt der CR bei jeder Ratte während der letzten Sitzung berechneten. Für die Latenzanalyse wurden nur Versuche verwendet, bei denen die Ratte eine CR zeigte. Aus jedem Versuch wurde die erste EMG-Amplitude in einem 1,3-s-Fenster ab 300 ms vor CS-Beginn extrahiert. Die EMG-Werte wurden dann vom Vorwert (EMG-Pre) subtrahiert und die ersten 300 ms der Daten wurden gemittelt und mit fünf multipliziert, um den CR-Schwellenwert zu generieren. Die Latenz bis zum Einsetzen der CR wurde dann als der erste Zeitpunkt in einem 500-ms-Fenster nach CS-Beendigung definiert, bei dem der EMG-Pre-Wert den CR-Schwellenwert überschritt. Die Latenz bis zum Höhepunkt der CR wurde als der Zeitpunkt während desselben 500-ms-Fensters definiert, an dem der EMG-Pre-Wert am höchsten war. Schließlich wurden die Beginn- und Spitzenlatenzzeiten in jedem Versuch über alle Versuche desselben Typs bei jeder Ratte gemittelt.

Ratten erhielten ab dem zweiten Tag der Gewöhnung und über alle 10 Tage von DTEBC1 hinweg intrakranielle Infusionen der ihnen zugewiesenen Lösungen. Ratten, die in einem flexiblen Plastikkegel gehalten wurden, erhielten 20 Minuten vor Beginn der Konditionierung eine Infusion. Die Infusion bestand entweder aus einer Muscimol-Hydrobromid-Lösung (0,5 mg in 0,5 ml künstlicher Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit [aCSF], G019 Sigma-Aldrich) oder aCSF. Innerhalb einer Minute wurden insgesamt 500 nl infundiert. Anschließend wurde die Infusionskanüle vor der Extraktion eine weitere Minute an Ort und Stelle belassen. Arzneimittelkonzentration, Infusionsvolumen und Infusionsrate wurden auf der Grundlage unserer früheren Studien ausgewählt, in denen festgestellt wurde, dass sich die Ausbreitung von Muscimol auf einen maximalen Bereich von 1 mm von der Kanülenspitze aus beschränkt47,48. Die Muscimol-Gruppe umfasste insgesamt acht Ratten, während die aCSF-Kontrollgruppe insgesamt neun Ratten umfasste.

Photometrische Aufzeichnungen der präfrontalen Terminals innerhalb des RE und MD wurden durch Messung der Massenfluoreszenz über eine einzelne optische Faser durchgeführt, durch die anregendes Licht abgegeben und emittierte Fluoreszenz erfasst wurde. Eine 465-nm-LED, moduliert bei 381 Hz, wurde verwendet, um GCaMP6f zu stimulieren und eine kalziumabhängige Fluoreszenz zu emittieren. Zur Stimulierung von GCaMP6f wurde eine 405-nm-LED verwendet, die bei 221 Hz moduliert wurde. Bei seiner isosbestischen Anregungswellenlänge emittiert es eine kalziumunabhängige Fluoreszenz. Die Modulation erfolgte über ein RZ5-Aufzeichnungssystem (Tucker Davis Technologies). Das Licht beider LEDs wurde in einen integrierten Fluoreszenz-Miniwürfel (IFMC, Doric Lenses) eingekoppelt, der beide Lichtströme in ein gekoppeltes Glasfaser-Patchkabel (NA 0,48, Kerngröße 400 µm, Doric Lenses) ausgab. Das Patchkabel wurde dann mithilfe einer undurchsichtigen Zirkonoxidhülse (Thorlabs) mit der implantierten Glasfaser- und Ferrulenanordnung verbunden. Die an der Spitze des Patchkabels gemessene Ausgangsleistung beider LEDs betrug 60 µW (PM100D, Thorlabs). Die vom Tier emittierte Fluoreszenz gelangte durch das Patchkabel in den IFMC, der an einen Femtowatt-Fotoempfänger (Doric Lenses) gekoppelt war. Die Ausgabe des Fotoempfängers wurde dann in das RZ5-Aufzeichnungssystem eingespeist, das die Ausgabe mit 1 kHz demodulierte und abtastete. Photometrische Aufzeichnungen fanden an den Tagen zwei bis 13 in Experiment 2 statt. Da jede Sitzung 75 Minuten dauerte, schalteten wir die LEDs nur für kurze Zeit an, abhängig von den Reizen, um die Photobleichung innerhalb jeder Sitzung zu minimieren. Am zweiten Tag (Hab 2) wurden die LEDs alle 30 Sekunden für neun Sekunden eingeschaltet. Am dritten Tag (Sitzung 0) wurden die LEDs vier Sekunden vor dem Einsetzen von TS, LS und US eingeschaltet und blieben bei jedem Versuch neun Sekunden lang eingeschaltet. An den Tagen vier bis 13 (Sitzungen eins bis zehn) wurden die LEDs vier Sekunden vor Beginn des CS eingeschaltet und blieben bei jedem Versuch insgesamt neun Sekunden lang eingeschaltet. Bei den ersten beiden konditionierten Ratten wurde bei der US-Abgabe während Sitzung 0 eine kleine Menge an Artefakten festgestellt, dieses Artefakt wurde weder bei TS noch bei LS beobachtet. In Übereinstimmung mit den nachfolgenden Analysen der terminalen Reaktionen auf den CS haben wir uns entschieden, nur die von TS und LS in Sitzung 0 hervorgerufene Aktivität zu analysieren.

Unter Verwendung eines benutzerdefinierten MATLAB-Codes wurde die Fluoreszenzaktivität einer 405-nm-Stimulation zur Korrektur von Bewegungsartefakten und Photobleichung verwendet. Erstens wurden aus jedem Versuch die 465-nm- und 405-nm-Signale der letzten sieben Sekunden der neun Sekunden dauernden LED-Einschaltdauer extrahiert, da sich die Fluoreszenzleistung innerhalb von zwei Sekunden nach dem Einschalten der LED stabilisierte. Das 405-nm-Signal wurde dann mithilfe eines linearen Anpassungsansatzes der kleinsten Quadrate an das 465-nm-Signal angepasst. Das ΔF/F wurde dann wie folgt berechnet: (465-nm-Signal – angepasstes 405-nm-Signal)/angepasstes 405-nm-Signal. Die resultierenden ΔF/F-Werte repräsentierten die Calciumaktivität zwei Sekunden vor und fünf Sekunden nach CS-Beginn in jedem Versuch. Die ΔF/F-Werte wurden dann über alle Versuche mit demselben Versuchstyp für diese Sitzung gemittelt.

Um die durch CS hervorgerufene Kalziumaktivität in den präfrontalen Terminals innerhalb des RE oder MD darzustellen, wurden die ΔF/F-Werte in einem Sechs-Sekunden-Fenster, beginnend zwei Sekunden vor CS-Beginn, zunächst nach Versuchstyp gruppiert und die Werte dann über die Versuche in jeder Sitzung gemittelt. Für den Vergleich der ΔF/F-Reaktionen auf verschiedene CS-Typen wurden die Werte der Fläche unter der Kurve (AUC) berechnet, indem die im Versuch gemittelten ΔF/F-Werte in einem Zwei-Sekunden-Fenster für jede Sitzung bei jeder Ratte summiert wurden. Für die Basis-AUC begann das Fenster zwei Sekunden vor dem Einsetzen des CS, während das Fenster für die CS-Reaktions-AUC mit dem Ende des CS begann. Die AUC-Werte wurden dann in jeder Sitzung über die Ratten gemittelt.

Nach Abschluss der Verhaltenstests wurden die Ratten mit einer überschüssigen Menge Natriumpentobarbital (80 mg/kg, Bimeda) tief betäubt. Sie wurden zunächst transkardial mit gekühlter 0,9 %iger physiologischer Kochsalzlösung perfundiert, gefolgt von gekühlter 4 %iger Paraformaldehyd (PFA). Die Gehirne wurden entnommen und zwei Stunden lang in 4 % PFA bei 4 °C getaucht, gefolgt von einem Eintauchen in phosphatgepufferte Kochsalzlösung – 30 % Saccharoselösung (PBS-Suc) für 48 Stunden. Mit einem Kryostat (CM3050S, Leica Biosystems) wurden koronale Hirnschnitte (45 μm) über die gesamte anterior-posteriore Ausdehnung des mPFC, RE und MD gesammelt. Gewebeschnitte wurden in mit Gewebeaufbewahrungspuffer (PBS-Suc und Ethylenglykollösung) gefüllten Röhrchen gelagert, alle Röhrchen wurden dann bei –20 °C gelagert. Um die Platzierung der Infusionskanülen zu lokalisieren, wurde Gewebe auf einen Glasobjektträger montiert und mit Kresylviolett gefärbt. Eine dünne Schicht Cytoseal 280-Montagelösung (Nr. 8311–4, Thermo Fisher Scientific) wurde zusammen mit einem Glasdeckglas aufgetragen. Die Objektträger wurden unter einem Lichtmikroskop (Leica DM400b) betrachtet. Um die Platzierung der optischen Fasern zu lokalisieren, wurde das Gewebe auf einen Glasobjektträger montiert und dann mit Cytoseal und einem Glasdeckglas versiegelt. Die Objektträger wurden unter einem aufrechten Fluoreszenzmikroskop (Zeiss AxioImager 2.0) betrachtet. Anschließend wurden die Positionen der Kanülen und optischen Fasern auf Platten aus dem stereotaktischen Atlas des Rattenhirns eingezeichnet49. In Experiment 1 wurden nur solche Ratten verwendet, deren Kanüle genau auf den RE oder MD zielte, und nur solche Ratten mit einer optischen Faser, die genau auf den RE oder MD zielte, wurden in Experiment 2 verwendet.

Die Stichprobengröße für Experiment 1 (pharmakologische Inaktivierung des RE) basierte auf unseren früheren Verhaltensstudien mit TEBC7,16,17. In ähnlicher Weise basierte die Stichprobengröße für Experiment 2 (Photometrie) auf der Stichprobengröße, die für die Berichterstattung über lokale Feldpotenzialdaten in unseren früheren Arbeiten verwendet wurde16,17,18. Die Daten wurden als Gruppenmittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Statistische Analysen wurden mit der Statistiksoftware MATLAB und SPSS (IBM) durchgeführt. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz verwendeten wir: einfaktorielle Varianzanalyse mit wiederholten Messungen (ANOVA), zweifaktorielle ANOVA mit gemischten/wiederholten Messungen, dreifaktorielle gemischte ANOVA, t-Test bei einer Stichprobe, gepaarte und ungepaarte t-Tests, linear Regressionsanalyse und Pearson-Korrelation. Die Signifikanz wurde als *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 definiert.

Zunächst wollten wir bestätigen, dass das RE für die Bildung von Reizassoziationen bei DTEBC notwendig ist, indem wir den Einfluss der pharmakologischen Inaktivierung des RE auf den CR-Erwerb untersuchten. Nach zwei Tagen Gewöhnungssitzungen absolvierten 22 Ratten 10 Akquisitionssitzungen, bei denen der Tonreiz mit dem US (TCS+) gepaart wurde, während der Lichtreiz (LCS-) allein präsentiert wurde (Abb. 1a). Vor jeder Aufnahmesitzung wurde der GABAA-Rezeptoragonist Muscimol in die RE von 11 Ratten (Muscimol-Gruppe) infundiert (Abb. 1b), während die anderen 11 Infusionen mit künstlicher Liquor cerebrospinalis erhielten (Kontrollgruppe). Fünf Ratten wurden aufgrund einer fehlerhaften Kanüle entfernt, so dass acht Ratten in der Muscimol-Gruppe und neun Ratten in der Kontrollgruppe zurückblieben (Abb. 1c). Über 10 Konditionierungssitzungen hinweg erhöhte die Kontrollgruppe schrittweise den Anteil der TCS+-Studien, in denen sie CRs exprimierten (Abb. 1d). Im Vergleich zu den Kontrollen exprimierte die Muscimol-Gruppe CRs in einer geringeren Anzahl von TCS+-Versuchen (Abb. 1d, dreifache gemischte ANOVA, Sitzung × Gruppe × CS-Typ-Interaktion, F(9.135) = 2,299, p = 0,020. Follow-up zwei- Weggemischte ANOVA für TCS+-Versuche, Sitzung, F(9,135) = 21,037, p < 0,001; Gruppe, F(1,15) = 8,266, p = 0,012; Sitzung × Gruppeninteraktion, F(9,135) = 3,264, p = 0,001 ). Insbesondere zeigte die Muscimol-Gruppe in der siebten Sitzung eine signifikant geringere Anzahl an CRs (ungepaarte t-Tests, korrigiert für Mehrfachvergleiche, t15 = 4,026, p = 0,001), während in den Sitzungen fünf bis sechs und acht bis zehn ein Trend zu einer geringeren CR-Expression zu verzeichnen war (p = 0,005–0,054). Parallel dazu zeigten beide Gruppen einen leichten Anstieg der Anzahl der in LCS-Studien ausgedrückten CRs; Allerdings war die Häufigkeit der CR-Expression in der Muscimol-Gruppe größer als in der Kontrollgruppe (zweifache gemischte Follow-up-ANOVA für LCS-Studien, Sitzung, F(9,135) = 2,362, p = 0,016; Gruppe, F(1,15) = 5,063, p = 0,040; Sitzung × Gruppeninteraktion, F(9,135) = 0,930, p = 0,502). Darüber hinaus zeigten beide Gruppen in den letzten drei Tagen einen höheren CR-Prozentsatz in TCS+ im Vergleich zu LCS--Versuchen (zweifache gemischte ANOVA auf dem durchschnittlichen CR-Prozentsatz der letzten drei Tage, Interaktion zwischen Gruppe und CS-Typ, F(1,15). ) = 8,732, p = 0,010; CS-Typ, F(1,15) = 85,170, p < 0,001; Gruppe, F(1,15) = 4,845, p = 0,044). Nachfolgende ungepaarte t-Tests, korrigiert um mehrere Vergleiche, ergaben, dass die Muscimol-Gruppe in TCS+-Studien im Vergleich zu den Kontrollen einen signifikant niedrigeren CR% aufwies (t15 = 2,665, p = 0,018), während CR% in LCS-Studien zwischen den Gruppen vergleichbar war (t15 = − 1,421, p = 0,176). Darüber hinaus unterschied sich die Muscimol-Gruppe nicht von der Kontrollgruppe hinsichtlich der Anzahl der Versuche, bei denen sie unmittelbar vor CS-Beginn Springen, Aufrichten oder Putzen zeigte (Abb. 1e, gemischte Zwei-Wege-ANOVA, Interaktion zwischen Sitzung und Gruppe, F (9,135) = 1,144, p = 0,336; Sitzung, F(9,135) = 1,765, p = 0,081; Gruppe, F(1,15) = 0,539, p = 0,474), was darauf hindeutet, dass die RE-Hemmung keinen Einfluss auf die Basisaktivitätsniveaus hatte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die RE-Hemmung die Fähigkeit von Ratten beeinträchtigte, Reizassoziationen zu bilden; Ihre Fähigkeit, Töne von Lichtreizen zu unterscheiden, blieb jedoch davon unberührt.

Die reversible Inaktivierung des RE beeinträchtigt das differenzielle assoziative Lernen, nicht jedoch die Reizunterscheidung. (a) Verhaltensparadigma. Die beiden Versuchstypen wurden nach dem Zufallsprinzip gemischt und in 50-minütigen Sitzungen präsentiert. (b) Konditionierte Reaktionen (CR) wurden durch Aufzeichnung der Elektromyogramm-Aktivität (EMG) des linken Orbicularis oculi (Augenlid)-Muskels erkannt. Eine Mikroinfusionskanüle wurde gezielt auf den RE implantiert. (c) Links drei: histologische Rekonstruktion der Kanülenspitzenpositionen im RE für alle in die endgültigen Analysen einbezogenen Ratten. Schwarze und rote Balken zeigen die Position der Infusionskanüle für die Kontrollgruppe (N = 9) bzw. die Muscimol-Gruppe (N = 8) an. Die Nummerierung oben gibt die Anterior-Posterior-Koordinaten (AP) von Bregma an. Rechts: repräsentativer Abschnitt im RE. (d) Anteil der Versuche, in denen Ratten die CR gegenüber TCS+ und LCS- exprimierten (*p < 0,05, Interaktion zwischen Gruppe × CS-Typ). Fehlerbalken geben ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) an. (e) Prozentsatz der hyperaktiven Studien (Mittelwert ± SEM). (f) Gemittelte normalisierte EMG-Amplitude in Sitzung 10. Blaue und grüne Rechtecke zeigen die TCS+- bzw. LCS-Präsentation an. Ein schwarzes Rechteck kennzeichnet die US-Präsentation. Die schattierten Bereiche zeigen ± SEM an.

Um zu untersuchen, ob die RE-Hemmung das zeitliche Muster der konditionierten Augenblinzelreaktion beeinflusst, haben wir in der letzten Sitzung die gemittelte integrierte CR für beide Gruppen und CS-Typen dargestellt (Abb. 1f). Im Vergleich zur Kontrollgruppe war die durchschnittliche EMG-Amplitude in TCS+-Studien in der Muscimol-Gruppe niedriger, was die geringere Anzahl exprimierter CRs weiter bestätigt (Abb. 1f oben). Allerdings waren die zeitlichen Muster der gemittelten EMG-Amplitude zwischen den beiden Gruppen vergleichbar. Es wurde kein Unterschied zwischen den Gruppen hinsichtlich ihrer Latenz bis zum Einsetzen der CR (Kontrollgruppe: 238 ± 36 ms; Muscimol-Gruppe: 226 ± 41 ms; ungepaarter t-Test, t15 = 0,225, p = 0,825) und auch nicht der Latenz bis zum Einsetzen der CR festgestellt Peak (Kontrollgruppe: 448 ± 10 ms; Muscimol-Gruppe: 411 ± 17 ms; t15 = 1,917, p = 0,074). In ähnlicher Weise wurden in LCS-Studien keine Unterschiede zwischen den Gruppen hinsichtlich ihrer Latenz bis zum Einsetzen (Kontrollgruppe: 192 ± 39 ms; Muscimol-Gruppe: 241 ± 57 ms; t15 = − 0,723, p = 0,481) und auch nicht der Latenz bis zum Höhepunkt festgestellt (Kontrollgruppe: 434 ± 17 ms; Muscimol-Gruppe: 416 ± 23 ms; t15 = 0,674, p = 0,510). Obwohl die RE-Hemmung die Anzahl der exprimierten CRs verringerte, hatte sie daher keinen Einfluss auf das gesamte zeitliche Muster der CRs.

Nachdem wir festgestellt hatten, dass die Integrität des RE für die Bildung einer Reizassoziation notwendig ist, untersuchten wir als nächstes, wie die präfrontalen Terminals innerhalb des RE und MD auf Reize reagierten, als Ratten sie mit dem Augenlidschock assoziierten. Zu diesem Zweck infundierten wir bilateral einen viralen Vektor in den mPFC, um den genetisch kodierten Calciumindikator (GCaMP6f.) in mPFC-Neuronen zu exprimieren (Abb. 2a). Die Aktivität ihrer Terminals im RE oder MD wurde durch eine chronisch implantierte optische Faser im RE oder MD überwacht (neun Ratten für jede Region). Expression von GCaMP6f. war in beiden Hemisphären in der prälimbischen (PrL) Region des mPFC lokalisiert, mit minimaler Expression im benachbarten anterioren cingulären (ACC) und infralimbischen Kortex (IL, Abb. 2b). Von den 18 Ratten wurden vier Ratten aufgrund einer Fehlausrichtung der optischen Fasern entfernt, und eine Ratte wurde aufgrund eines Bruchs des inneren Faserkerns während der Verhaltenskonditionierung entfernt. Damit blieben insgesamt sechs Ratten mit optischen Fasern, die auf Terminals innerhalb der RE (RE-Gruppe) abzielten, und sieben Ratten mit Fasern, die auf die MD abzielten (MD-Gruppe, Abb. 2c), zurück. Alle nachfolgenden Analysen in Experiment 2 wurden daher nur an diesen Ratten durchgeführt. Wir haben bestätigt, dass sich das kalziumabhängige 465-nm-Signal deutlich vom kalziumunabhängigen 405-nm-Signal unterschied (Abb. 2d). Die aus diesen beiden Signalen berechneten ΔF/F-Werte ermöglichten es uns, Kalziumtransienten abzüglich jeglicher Kontamination durch Photobleichung oder Bewegungsartefakte zu untersuchen (siehe Methoden).

Präfrontale Terminals innerhalb des RE werden nicht durch sensorische Hinweise aktiviert, denen es an mnemonischen Qualitäten mangelt. (a) Präfrontale (prälimbische Region [PrL]) Terminals, die GCaMP6f exprimieren. wurden im RE oder MD erfasst. (b) Histologische Rekonstruktion und repräsentativer Abschnitt des mPFC mit GCaMP6f. Ausdruck (grün). Virusinfusionen erfolgten beidseitig; Die einzelnen Hemisphären wurden überlagert, um die Ausbreitung in beiden Hemisphären darzustellen. Die Nummerierung gibt die AP-Koordinate von Bregma an. Abkürzungen: anteriorer cingulärer Kortex (ACC), infralimbischer Kortex (IL). (c) Oben: histologische Rekonstruktion der Platzierung der Glasfaserspitzen im RE und MD. Unten: repräsentative Ausschnitte im vergrößerten Bereich. Die Nummerierung gibt die AP-Koordinate von Bregma an. (d) Repräsentative kalziumabhängige (465 nm) und unabhängige (405 nm) Signale aus der photometrischen Aufzeichnung präfrontaler Terminals innerhalb des MD bei einer repräsentativen Ratte während der Tondarstellung. Zwei vertikale Linien zeigen den Beginn und das Ende des Tons an. Gestrichelte Linien zeigen ± SEM (N = 25 Präsentationen). (e) Präfrontale terminale Reaktionen auf Reize in Sitzung 0, gemittelt über Ratten hinweg. Schattierte Bereiche zeigen ± SEM (RE, N = 6 Ratten; MD, N = 7 Ratten). (f) Basislinie der Sitzung 0 und CS-evozierte AUC, berechnet durch Summierung der ΔF/F-Werte in einem Zwei-Sekunden-Fenster unmittelbar vor bzw. nach CS-Präsentationen (*p < 0,05, vs. Baseline). Fehlerbalken zeigen ± SEM an (RE, N = 6 Ratten; MD, N = 7 Ratten).

Wir untersuchten zunächst die terminalen Reaktionen auf zwei neutrale Sinnesreize vor der Konditionierung. Nach zwei Tagen Gewöhnungssitzungen wurden die Ratten einer Sitzung mit Vorkonditionierungsreiztests (Sitzung 0) unterzogen. Dabei handelte es sich um Versuche, bei denen nur ein Ton- (TS) oder ein Lichtreiz (LS) präsentiert wurde. Während der Sitzung 0 lösten Präsentationen sowohl des TS als auch des LS starke und klar definierte Reaktionen von präfrontalen Terminals innerhalb des MD aus, während die terminalen Reaktionen im RE schwach waren und schwerer von der Grundaktivität zu unterscheiden waren (Abb. 2e). Um zu quantifizieren, ob diese Reaktionen signifikant größer als die Basisaktivität waren, berechneten wir die Fläche unter der Kurve (AUC) für unsere ΔF/F-Werte während eines Zwei-Sekunden-Fensters vor und nach CS-Beginn. Wir fanden heraus, dass Terminals innerhalb des RE im Vergleich zur Basisaktivität durch die Präsentation von TS oder LS nicht signifikant aktiviert wurden (Abb. 2f links, Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen [RM], Zeitperiode × CS-Typ-Wechselwirkung, F( 1,5) = 0,391, p = 0,559; Zeitraum, F(1,5) = 1,700, p = 0,249; CS-Typ, F(1,5) = 0,112, p = 0,751). Umgekehrt wurden Terminals innerhalb der MD durch beide Reize stark aktiviert (Abb. 2f rechts, zweifache RM-ANOVA, Zeitperiode × CS-Typ-Wechselwirkung, F(1,6) = 1,112, p = 0,332; Zeitperiode, F(1). ,6) = 10,061, p = 0,019; CS-Typ, F(1,6) = 0,125, p = 0,736). Diese Ergebnisse legen nahe, dass neuartige sensorische Reize ohne jegliche mnemonische Eigenschaften die präfrontalen Terminals innerhalb der MD stark aktivieren, nicht jedoch die RE.

Nach Sitzung 0 wurden die Ratten 10 Tage lang in DTEBC2 konditioniert (Abb. 3a). Der Ton wurde als CS+ für 10 Ratten verwendet, von denen fünf über eine optische Faser verfügten, die auf den RE und die anderen fünf auf den MD zielte. Das Licht wurde als CS+ bei den verbleibenden ein und zwei Ratten mit einer optischen Faser im RE bzw. MD verwendet. Über 10 Konditionierungssitzungen hinweg steigerten alle 13 Ratten nach und nach den Anteil der CS+US- und CS+-Versuche, in denen sie CRs exprimierten. Während die Anzahl der CRs in CS-Studien niedrig blieb (Abb. 3b, zweifache RM-ANOVA, Interaktion zwischen Sitzung und CS-Typ, F(18.216) = 18,418, p < 0,001; Sitzung, F(9,108) = 36,220, p < 0,001; CS-Typ, F(2, 24) = 72,052, p < 0,001). Während der letzten drei Tage war der CR% in CS+US- und CS+-Versuchen im Vergleich zu CS-Versuchen signifikant höher (einfaktorielle RM-ANOVA auf dem durchschnittlichen CR% über die letzten drei Tage, CS-Typ, F(2,24) = 185,663, p < 0,001. Gepaarter t-Test korrigiert für mehrere Vergleiche (CS- vs., CS+US: t12 = 16,541, p < 0,001; CS+: t12 = 13,524, p < 0,001). Es gab keinen Unterschied in der CR % zwischen CS+US- und CS+-Studien (gepaarter t-Test korrigiert um mehrere Vergleiche, t12 = 0,385, p = 0,707). Die Untersuchung der gemittelten integrierten CR für den letzten Tag der Konditionierung ergab ähnliche zeitliche Muster der Augenblinzelreaktion wie in Experiment 1 (Abb. 3c).

Verhalten während der Photometrieaufzeichnung. (a) Verhaltensparadigma. Die drei Versuchstypen wurden nach dem Zufallsprinzip gemischt und in 75-minütigen Sitzungen präsentiert. (b) Anteil der Versuche, in denen Ratten (N = 13) die CR in jedem der drei Versuchstypen exprimierten (*p < 0,05, Interaktion zwischen Sitzung und CS-Typ). Fehlerbalken zeigen ± SEM an. (c) Gemittelte normalisierte EMG-Amplitude in Sitzung 10. Das graue Rechteck zeigt die CS-Präsentation an. Der Bereich mit hoher Amplitude der rosa Kurve (CS+US) stellt das Artefakt dar, das durch die Abgabe des US verursacht wird. Die schattierten Bereiche zeigen ± SEM an.

Während der täglichen Konditionierungssitzungen haben wir die Kalziumaktivität der präfrontalen Terminals im RE (Abb. 4a) von sechs Ratten aufgezeichnet. Wir fanden heraus, dass Terminals innerhalb des RE in den ersten Sitzungen in ähnlicher Stärke auf CS+ und CS- reagierten (Abb. 4b, c). Mit fortschreitender Konditionierung löste CS+ nach und nach stärkere Reaktionen aus; wohingegen die Reaktionen auf das CS- schwächer wurden und dann durchgehend niedrig blieben. Um die Änderung der Reaktion über Tage hinweg besser zu quantifizieren, haben wir die AUC berechnet, indem wir die ΔF/F-Werte während eines Zwei-Sekunden-Fensters direkt nach der CS-Beendigung summierten. Wir fanden heraus, dass die durch CS+ hervorgerufene Reaktion signifikant größer war als die durch CS- (Abb. 4d, Zwei-Wege-RM-ANOVA, Sitzung × CS-Typ-Interaktion, F(9,45) = 2,839, p = 0,010; Sitzung, F(9, 45) = 0,695, p = 0,709; CS-Typ, F(1,5) = 47,743, p = 0,001). Nachfolgende lineare Regressionsanalysen ergaben, dass die durch CS+ hervorgerufenen Reaktionen bei fünf von sechs RE-Ratten über die Tage der Konditionierung an Stärke zunahmen (fünf Ratten p < 0,05, eine Ratte p = 0,411). Im Gegensatz dazu wurden keine signifikanten Auswirkungen für CS- beobachtet. evozierte Reaktionen (sechs Ratten p > 0,05).

Das Ausmaß der durch CS+ hervorgerufenen Aktivität in den präfrontalen Terminals innerhalb des RE nimmt parallel zur Bildung der Reizassoziation zu. (a) Präfrontale (prälimbische Region [PrL]) Terminals, die GCaMP6f exprimieren. wurden im RE erfasst. (b) Links: ΔF/F-Werte, gemittelt über die ersten drei Tage der Konditionierung. Rechts: das Gleiche wie links, jedoch für die letzten drei Tage der Konditionierung. Vertikale schwarze Linien stellen den Beginn und das Ende des CS dar. Die schattierten Bereiche zeigen ± SEM an. (c) Links: gemittelte ΔF/F-Werte der präfrontalen Terminals innerhalb des RE als Reaktion auf CS+ über Tage der Konditionierung (y-Achse, von oben nach unten absteigend), aufgetragen gegen die Zeit (x-Achse). Vertikale weiße Linien stellen den Beginn und das Ende des CS+ dar. Rechts: wie links, jedoch mit CS-. (d) Gemittelte AUC in einem Zwei-Sekunden-Fenster unmittelbar nach der CS-Präsentation, aufgetragen gegen die Tage der Konditionierung (*p < 0,05, Interaktion zwischen Sitzung und CS-Typ). Fehlerbalken zeigen ± SEM an.

In einer separaten Kohorte von sieben Ratten haben wir die Kalziumaktivität der präfrontalen Terminals innerhalb des MD während täglicher Konditionierungssitzungen aufgezeichnet (Abb. 5a). Präfrontale Terminals innerhalb des MD zeigten ab der ersten Sitzung stärkere Reaktionen auf CS+ als auf CS- (Abb. 5b, c). Der Unterschied in der Antwortgröße zwischen CS+ und CS- schien in den folgenden Sitzungen stärker zu sein, was hauptsächlich auf die stärkeren Reaktionen auf CS+ zurückzuführen war. Diese visuellen Eindrücke wurden jedoch durch die statistische Analyse der AUC-Werte nicht bestätigt (Abb. 5d, Zwei-Wege-RM-ANOVA, Sitzung × CS-Typ-Interaktion, F(9,54) = 0,869, p = 0,586; Sitzung, F (9,54) = 1,530, p = 0,161; CS-Typ, F(1,6) = 9,000, p = 0,024). Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass CS+ im Vergleich zu CS- zwar einen größeren präfrontalen Output sowohl beim RE als auch beim MD hervorrief, die Entwicklung dieses Outputs jedoch zwischen den beiden Gehirnregionen unterschiedlich war. Grundsätzlich verstärkte sich der präfrontale Output an den RE über die Konditionierungstage hinweg, während der Output an den MD für den CS+ am ersten Konditionierungstag stärker wurde und über die folgenden Tage hinweg stabil gehalten wurde.

Der CS+ rief ab der ersten Konditionierungssitzung eine größere Aktivität in den präfrontalen Terminals innerhalb des MD hervor als der CS-. (a) Präfrontale (PrL-Region) Terminals, die GCaMP6f exprimieren. wurden im MD erfasst. (b) Links: ΔF/F-Werte, gemittelt über die ersten drei Tage der Konditionierung. Rechts: das Gleiche wie links, jedoch für die letzten drei Tage der Konditionierung. Vertikale schwarze Linien stellen den Beginn und das Ende des CS dar. Die schattierten Bereiche zeigen ± SEM an. (c) Links: gemittelte ΔF/F-Werte der präfrontalen Terminals innerhalb des MD als Reaktion auf CS+ über Tage der Konditionierung (y-Achse, von oben nach unten absteigend), aufgetragen gegen die Zeit (x-Achse). Vertikale weiße Linien stellen den Beginn und das Ende des CS+ dar. Rechts: wie links, jedoch mit CS-. (d) Gemittelte AUC in einem Zwei-Sekunden-Fenster unmittelbar nach der CS-Präsentation, aufgetragen gegen die Tage der Konditionierung (*p < 0,05, Haupteffekt des CS-Typs). Fehlerbalken zeigen ± SEM an.

Um die Unterschiede zwischen der präfrontalen Ausgabe von RE und MD direkter zu vergleichen, haben wir die über die letzten drei Tage der Konditionierung gemittelte reizbedingte AUC durch die reizbedingte AUC vor der Konditionierung (Sitzung 0) geteilt. Diese normalisierte AUC quantifizierte die relative Änderung der durch CS hervorgerufenen terminalen Aktivität vor und nach assoziativem Lernen. Die Änderung der durch CS+ hervorgerufenen Reaktion war in Terminals innerhalb des RE signifikant größer als in denen innerhalb des MD (Abb. 6a, zweifache gemischte ANOVA, Interaktion zwischen Gruppe × CS-Typ, F(1,11) = 4,942, p = 0,048; Gruppe, F(1,11) = 2,297, p = 0,158; CS-Typ, F(1,11) = 10,508, p = 0,008. Follow-up ungepaarter t-Test, t11 = 2,320, p = 0,041). Im Gegensatz dazu war die Veränderung der durch CS hervorgerufenen Reaktionen zwischen den Terminals innerhalb des RE und MD vergleichbar (t11 = 0,535, p = 0,603). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Bildung von Reizassoziationen zu einem stärkeren Anstieg des präfrontalen Outputs zum RE als zum MD führte.

Die Bildung der CS+US-Assoziation geht mit einem stärkeren Anstieg der durch CS+ hervorgerufenen Aktivität in präfrontalen Terminals innerhalb des RE im Vergleich zum MD einher. (a) Vergleich der durch CS+ und CS- hervorgerufenen AUC zwischen präfrontalen Terminals innerhalb des RE (N = 6) und MD (N = 7, *p < 0,05). Die AUC wurde während der letzten drei Tage der Konditionierung gemittelt und unter Verwendung der CS-evozierten AUC-Werte der Sitzung 0 normalisiert. Fehlerbalken zeigen ± SEM an. (b) Korrelationen von CR% mit CS riefen die AUC bei zwei repräsentativen Ratten hervor. Punkte in jedem Diagramm stellen den CR% für CS+- oder CS--Versuche dar, aufgetragen gegen den AUC-Wert für denselben Versuchstyp über alle 10 Sitzungen hinweg. Oben: RE-Faserratte. Unten: MD-Faserratte (*p < 0,05). (e) Vergleich der gemittelten Korrelationskoeffizienten zwischen CR% und AUC (RE, N = 6; MD, N = 7). Fehlerbalken zeigen ± SEM an.

Um die Beziehung zwischen präfrontalen Thalamus-Outputs und assoziativem Lernen weiter zu verschärfen, haben wir den Pearson-Korrelationskoeffizienten (r) zwischen AUC-Werten und CR% für beide CS-Typen über die 10 Konditionierungssitzungen berechnet. Von den sechs RE-Ratten zeigten drei eine signifikante (p <0,05) positive Korrelation zwischen der Stärke der Reaktion und CR% (Abb. 6b). Von den sieben MD-Ratten zeigten drei eine signifikant positive Korrelation. Als Gruppe (Abb. 6c) unterschieden sich die R-Werte sowohl in der RE-Gruppe (T-Test bei einer Stichprobe, t5 = 3,720, p = 0,014) als auch in der MD-Gruppe (t6 = 9,056, p = 0,001) signifikant von Null. Die R-Werte waren auch zwischen RE- und MD-Gruppen vergleichbar (ungepaarter t-Test, t11 = 0,713, p = 0,491). Somit waren die präfrontalen Ausgänge an RE und MD selektiv für Reizassoziationen; Allerdings zeigten nur die präfrontalen Ausgänge zum RE eine größere Verbesserung der assoziativen Selektivität beim Lernen.

Immer mehr Beweise aus Verhaltensstudien haben gezeigt, dass RE, insbesondere der mPFC-zu-RE-Weg, eine wichtige Rolle bei Gedächtnisbildungsprozessen spielt, die auf einer engen Kommunikation zwischen mPFC und HPC beruhen22,23,24. In früheren Studien wurde jedoch nicht untersucht, inwieweit die mPFC-Ausgänge an den RE durch die sensorischen und relationalen Merkmale von Aufgabenreizen moduliert werden. Durch die Überwachung der Aktivität präfrontaler Projektionen, die im RE enden, stellten wir fest, dass die präfrontale Endaktivität durch einen Reiz erst dann stark aktiviert wurde, wenn der Reiz mit einem aversiven Ergebnis verbunden war. Das Ausmaß der durch den Reiz hervorgerufenen Endaktivität korrelierte positiv mit der Stärke der erlernten Reizassoziation. Darüber hinaus war der lernbedingte Anstieg der terminalen Reaktionen beim RE größer als bei einem anderen Thalamus-Output-Ziel, dem MD. Dies unterstreicht die einzigartige Rolle des mPFC-zu-RE-Weges bei der Weiterleitung von Informationen im Zusammenhang mit der Verhaltensrelevanz sensorischer Reize beim assoziativen Lernen.

Unsere photometrischen Aufzeichnungen zeigten, dass präfrontale Terminals innerhalb des RE nicht als Reaktion auf akustische und visuelle Reize aktiviert wurden, die von ihnen selbst präsentiert wurden (Sitzung 0; Abb. 2e, f). Beim Lernen wurden sie jedoch durch einen der Reize, die mit einem Augenlidschock gepaart waren, stark aktiviert, nicht jedoch durch den anderen Reiz, der allein präsentiert wurde (Abb. 4d). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die festgestellte Änderung der mPFC-zu-RE-Ausgabe auf assoziatives Lernen zurückzuführen ist, nicht jedoch auf die Sensibilisierung gegenüber wiederholt präsentierten Sinnesreizen. Ähnliche unterschiedliche Aktivitätsmuster wurden zuvor für die mPFC-Oszillations-17,18 und Spitzenaktivität12,14,15,50,51 berichtet. Darüber hinaus erleichtert eine Manipulation, die diese unterschiedliche Aktivität verstärkt, die Bildung von Reizassoziationen16,17. Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass der mPFC eine entscheidende Rolle bei der Erkennung und Kodierung relevanter Reizassoziationen spielt52. Die vorliegenden Ergebnisse erweitern diese Vorstellung, indem sie zeigen, dass die erkannte Relevanz auf den RE zurückzuführen ist.

Wenn der RE pharmakologisch inaktiviert wurde, konnten Ratten keinen Zusammenhang zwischen dem Reiz und dem aversiven Ergebnis herstellen, ihre Reaktionen auf den anderen Reiz, der allein präsentiert wurde, erhöhten sich jedoch nicht (Abb. 1d). Diese Muster deuten darauf hin, dass der RE für die Bildung von Reizassoziationen notwendig ist, nicht jedoch für die sensorische Diskriminierung. Die vorliegende Beobachtung steht im Einklang mit früheren Berichten, dass RE-Störungen durch entweder Muscimol53 oder hochfrequente elektrische Stimulation40 den Gedächtniserwerb bei Spurenangst bzw. Spurenkonditionierung des Augenzwinkerns beeinträchtigten. Gleichzeitig zeigten Ratten trotz RE-Inaktivierung immer noch ein geringes Maß an assoziativem Lernen. Dies ist wahrscheinlich das Ergebnis einer unvollständigen RE-Inaktivierung, da sich das RE weit über die anterior-posteriore Achse erstreckt, was über die Ausbreitung unseres infundierten Muscimol hinausgeht.

Angesichts der Selektivität präfrontaler Projektionen im RE für die Verhaltensrelevanz sensorischer Ereignisse könnten die beobachteten Lerndefizite nach RE-Hemmung auf den Entzug des HPC vom mPFC-Relevanzsignal zurückzuführen sein. Alternativ könnte die RE-Hemmung auch die Synchronisation der neuronalen Aktivität zwischen mPFC und HPC stören, die bekanntermaßen eine wesentliche Rolle beim zeitlich assoziativen Lernen spielt 19,54. Bei mit Urethan anästhesierten Ratten störte die RE-Inaktivierung sowohl das zeitliche Muster des Gamma-Bursts (GB) als auch seine Synchronizität zwischen mPFC und CA1; Die Häufigkeit dieser GB-Vorkommen in beiden Regionen blieb jedoch davon unberührt30. In jüngerer Zeit haben wir herausgefunden, dass die Inzidenzrate von mPFC GB während der Trace-Intervalle bei DTEBC positiv mit der Aufgabenübernahme korreliert18. Wenn ein ähnlicher GB gleichzeitig auch in CA1 auftritt, könnte die RE-Hemmung ihre Synchronität stören, was zu einer gestörten mPFC-HPC-Kommunikation führt. Da wir mPFC-zu-RE-Projektionen nicht selektiv gehemmt haben, kann die Lernbeeinträchtigung durch RE-Hemmung außerdem auf die Störung der Informationsübertragung und/oder modulatorische Effekte vom dorsalen HPC zum mPFC über das RE zurückzuführen sein.

Parallel zu seiner Rolle beim Information Gating wurde in mehreren Arbeiten mit kontextuellen Angstkonditionierungsaufgaben argumentiert, dass der RE auch die Präzision kontextueller Angsterinnerungen kontrolliert35,36,37,38. Insbesondere führte die Inaktivierung der mPFC-Ausgabe an den RE oder die direkte Unterdrückung von RE-Projektionen zum Erwerb eines Angstgedächtnisses, dem die Selektivität für den ursprünglichen Konditionierungskontext fehlte35. Bemerkenswert ist, dass ungenaue kontextuelle Erinnerungen, die in Zeiten der Inaktivierung des RE erworben wurden, unabhängig vom Hippocampus erworben werden36. Bei der kontextuellen Angstkonditionierung bilden Probanden mit eingeschränkter Hippocampusfunktion eine elementare Assoziation des Fußschocks mit einem einfachen Umweltreiz, jedoch nicht mit detaillierten Darstellungen der Konditionierungsumgebung, was zum Verlust der Kontextspezifität führt55,56. Daher könnte die offensichtliche Rolle von RE bei der Steuerung der Gedächtnispräzision eine Manifestation seiner allgemeineren Rolle bei der Modulation des Engagements des HPC bei der Speicherkodierung sein36. Diese Idee passt gut zu den beobachteten Lerndefiziten unserer Aufgabe. Insbesondere in TEBC ist das HPC erforderlich, um die zeitliche Lücke zwischen CS und US zu überbrücken, die nicht durch die Anwendung einer Lernstrategie auf niedrigem Niveau umgangen werden kann1,2,3. Somit führte die RE-Hemmung zu einer beeinträchtigten CR-Erfassung (Abb. 1d), da sie den HPC während der Konditionierung nicht ausreichend aktivieren konnte. Unsere Photometriedaten erweiterten diese Idee weiter, indem sie darauf hindeuteten, dass diese Funktionalität des RE durch den mPFC-Ausgang gesteuert wird, der die Relevanz laufender Ereignisse signalisiert.

Der MD ist wechselseitig mit dem mPFC41,42,43 verbunden, aber es fehlen Projektionen zum und vom HPC44,45. Dieses anatomische Merkmal veranlasste uns, die präfrontalen Ausgaben zwischen MD und RE zu vergleichen und dabei mehrere Eigenschaften zu entdecken, die für die mPFC-Projektionen auf den MD einzigartig sind. Erstens wurden die präfrontalen Terminals im MD durch sensorische Reize stark aktiviert, bevor die Konditionierung begann. Zweitens unterschieden die präfrontalen Ausgänge zum MD nach Beginn der Konditionierung zwischen CS+ und CS-, bevor die Ratten unterschiedliche CRs entwickelten (Abb. 3b und 5d). Darüber hinaus nahm die Reaktionsstärke in den nachfolgenden Konditionierungssitzungen nicht zu. Basierend auf diesen Erkenntnissen argumentieren wir, dass die Schleife zwischen mPFC und MD dazu beiträgt, die Reizdarstellungen innerhalb des mPFC während der Reiz-Ergebnis-Intervalle aufrechtzuerhalten, wie dies in verschiedenen Formen von Arbeitsgedächtnisaufgaben vorgeschlagen wird45,57,58,59,60,61,62. Beispielsweise sind MD-Terminals innerhalb des mPFC für das anhaltende Abfeuern von mPFC-Neuronen während der Verzögerungszeit einer verzögerten Nichtübereinstimmung mit der Stichproben-T-Labyrinth-Aufgabe57 erforderlich. Darüber hinaus wurde bei einer anderen WM-Aufgabe, die die Aufrechterhaltung eines sensorischen Hinweises über einen Verzögerungszeitraum für eine nachfolgende regelbasierte Auswahl erfordert, festgestellt, dass die MD-Aktivität im Verzögerungszeitraum von Eingaben von reizselektiven mPFC-Neuronen abhängt58,61. Diese Studien unterstreichen die Bedeutung von MD-Projektionen für den mPFC bei der Aufrechterhaltung verhaltensrelevanter Informationen und die Abhängigkeit des MD von durch Reize hervorgerufenen mPFC-Ausgaben, um diesen Prozess einzuleiten. Auf dieser Grundlage sollten neuartige oder möglicherweise relevante Reize eine mPFC-Ausgabe an den MD hervorrufen, da das Tier den Reiz in einem aktiven Zustand halten müsste, um beurteilen zu können, ob er verhaltensrelevant genug ist, um seine Bindung an das Gedächtnis zu rechtfertigen. Diese Ansicht bestätigt sich auch mit Erkenntnissen aus Studien, in denen Kaninchen mit MD-Läsionen eine größere Anzahl von Konditionierungssitzungen benötigten, um die Reizassoziation zu bilden, verglichen mit nicht-läsionierten Kontrollen in TEBC63, während die Leistung bei der Verzögerungs-Augenzwinker-Konditionierung, bei der es kein Spurenintervall gibt, nur minimal ist , wenn überhaupt, betroffen64,65.

Unsere Ergebnisse hier identifizierten funktionelle Dissoziationen zwischen zwei wichtigen präfrontal-thalamischen Bahnen, indem sie den lerninduzierten Anstieg der präfrontalen Ausgabe an den RE aufdeckten, was darauf hindeutet, dass die an den RE ausgegebenen Informationen für die Beziehungsmerkmale sensorischer Reize signalisieren. Zukünftige Studien müssen untersuchen, welche Art von Informationen vom RE an den HPC gesendet werden und wie sie sich auf die neuronale Verarbeitung im Hippocampus auswirken, die das zeitliche assoziative Lernen unterstützt.

Alle in dieser Studie generierten und analysierten Daten sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde durch den NSERC Discovery Grant (RGPIN-2020-04479) und den CFI Leaders Opportunity Fund (25026; [KT-N.]) sowie das NSERC Postgraduate Scholarships-Doctoral Program (PGSD2-535097; [XY]) unterstützt. .

Abteilung für Zell- und Systembiologie, University of Toronto, Toronto, Kanada

Xiaotian Yu & Kaori Takehara-Nishiuchi

Humanbiologieprogramm, University of Toronto, Toronto, Kanada

Jembere-Sand

Institut für Psychologie, University of Toronto, Toronto, Kanada

Kaori Takehara-Nishiuchi

Kooperationsprogramm in Neurowissenschaften, University of Toronto, Toronto, Kanada

Xiaotian Yu & Kaori Takehara-Nishiuchi

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Experimentelles Design von XY und KT-N.; alle von XY durchgeführten Operationen und Experimente mit Unterstützung von FJ bei der Histologie; Alle Daten wurden von XY unter Anleitung von KT-N analysiert.; erster Entwurf des Manuskripts verfasst von XY und KT-N.; Manuskript herausgegeben von allen Autoren; Endgültiges Manuskript erstellt von XY und KT-N.

Korrespondenz mit Kaori Takehara-Nishiuchi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yu, X., Jembere, F. & Takehara-Nishiuchi, K. Präfrontale Projektionen auf den Nucleus reuniens signalisieren die Verhaltensrelevanz von Reizen während des assoziativen Lernens. Sci Rep 12, 11995 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-15886-0

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Eingegangen: 02. Mai 2022

Angenommen: 30. Juni 2022

Veröffentlicht: 14. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-15886-0

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