MYT1L-Haploinsuffizienz in menschlichen Neuronen und Mäusen verursacht Autismus

Molekulare Psychiatrie (2023)Diesen Artikel zitieren

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MYT1L ist ein mit der Autismus-Spektrum-Störung (ASD) assoziierter Transkriptionsfaktor, der lebenslang in praktisch allen Neuronen exprimiert wird. Wie MYT1L-Mutationen neurologische Phänotypen verursachen und ob sie gezielt bekämpft werden können, bleibt rätselhaft. Hier untersuchen wir die Auswirkungen eines MYT1L-Mangels in menschlichen Neuronen und Mäusen. Mutierte Mäuse weisen neurologische Entwicklungsverzögerungen mit dünneren Kortizes, Verhaltensphänotypen und Genexpressionsveränderungen auf, die denen von ASD-Patienten ähneln. MYT1L-Zielgene, einschließlich WNT und NOTCH, werden bei MYT1L-Depletion aktiviert und ihre chemische Hemmung kann eine verzögerte Neurogenese in vitro retten. Ein MYT1L-Mangel führt auch zu einer Hochregulierung des wichtigsten kardialen Natriumkanals SCN5A und zu neuronaler Hyperaktivität, die durch shRNA-vermittelte Unterdrückung der SCN5A- oder MYT1L-Überexpression in postmitotischen Neuronen wiederhergestellt werden könnte. Die akute Anwendung des Natriumkanalblockers Lamotrigin rettete auch elektrophysiologische Defekte in vitro und Verhaltensphänotypen in vivo. Daher verursacht die MYT1L-Mutation sowohl Entwicklungs- als auch postmitotische neurologische Defekte. Eine akute Intervention kann jedoch die daraus resultierenden elektrophysiologischen und Verhaltensphänotypen im Erwachsenenalter normalisieren.

Die Autismus-Spektrum-Störung (ASD) ist eine häufige neurologische Entwicklungsstörung (NDD), die durch Verhaltensänderungen, einschließlich veränderter sozialer Muster, gekennzeichnet ist [1]. ASD wird häufig mit gleichzeitig bestehenden Erkrankungen wie Epilepsie, geistiger Behinderung und Hyperaktivität in Verbindung gebracht. Genmutationen, die die neuronale Kommunikation beeinflussen, erhöhen das Risiko für ASD und bieten mögliche therapeutische Angriffspunkte [2]. Die genetische Heterogenität von ASD ist jedoch enorm und mehrere Transkriptionsregulatoren wurden kürzlich mit dieser Gruppe von Störungen in Verbindung gebracht. Tatsächlich zeigen Mausmodelle, dass Mutationen von Chromatin-Remodellierern wie Chd8 und Mitgliedern des BAF-Komplexes wie Smarcc2 Verhaltensphänotypen induzieren können [3,4,5,6], was auf eine mögliche kausale Rolle bei ASD schließen lässt. Ihr Beitrag zur Krankheit und ihre klinische Relevanz bleiben jedoch oft unklar [7], was die Entwicklung gezielter Behandlungen für Genregulator-assoziierte psychische Störungen zum Zeitpunkt der Diagnose einschränkt [8, 9].

Von den 91 Chromatin- oder Genregulatoren, die am stärksten mit ASD assoziiert sind (Kategorie 1; [10]), wird MYT1L während des gesamten Lebens spezifisch und kontinuierlich in praktisch allen Neuronen exprimiert [10,11,12]. MYT1L ist ein konservierter Zinkfinger-Transkriptionsfaktor und es wurden Mutationen bei Patienten mit diagnostizierter geistiger Behinderung, Schizophrenie, Epilepsie und ASD berichtet [13,14,15,16,17,18], was darauf hindeutet, dass die MYT1L-vermittelte Genregulation wichtig sein könnte bei der Verhinderung von NDDs einschließlich ASD. Tatsächlich wurde bei 98 % (50 von 51) der derzeit gemeldeten Fälle mit heterozygoter MYT1L-Deletion oder Funktionsverlustmutationen ASD und/oder geistige Behinderung diagnostiziert [19]. Neben Verhaltensmerkmalen weisen mehrere Patienten mit MYT1L-Mutationen auch Entwicklungsverzögerungen, Fettleibigkeit, Krampfanfälle und Fehlbildungen des Gehirns auf [19]. MYT1L war einer der drei ursprünglichen Faktoren, die Fibroblasten bei Überexpression direkt in funktionelle Neuronen umprogrammieren konnten [20]. MYT1L ist ein Transkriptionsrepressor, der die neuronale Identität in vitro verbessern kann, indem er mehrere Entwicklungspfade, einschließlich WNT und NOTCH, aktiv unterdrückt. Dies wird teilweise durch die Rekrutierung epigenetischer Schalldämpfer wie SIN3/HDAC erreicht [21,22,23]. Unerwarteterweise haben Reprogrammierungsexperimente auch gezeigt, dass MYT1L mehrere nicht-neuronale Genprogramme wie Muskel- und Fibroblastengene bindet und unterdrückt, was auf eine Rolle als pan-neuronaler Schutz schließen lässt, der andere linienspezifische Gene zum Schweigen bringt [21, 24, 25]. Tatsächlich wurde in neueren Studien beschrieben, dass eine Myt1l-Haploinsuffizienz, die durch eine Frameshift-Mutation von Myt1l-Exon 15 oder eine Deletion von Exon 9 verursacht wird, bei Mäusen eine veränderte Gehirnentwicklung und Verhaltensphänotypen hervorruft [26, 27]. Allerdings bleiben eine Reihe wichtiger Fragen unbeantwortet. Es ist beispielsweise unklar, ob unterschiedliche MYT1L-Mutationen überlappende Phänotypen verursachen, wie es aufgrund von Patientenberichten vermutet wird. Darüber hinaus gibt es keine Studien, die die Auswirkungen der MYT1L-Depletion in menschlichen Neuronen belegen. Schließlich sind die molekularen Mechanismen, die die neurologischen Phänotypen verursachen, und ob sie einer Intervention zugänglich sind, unbekannt.

Hier verwendeten wir gentechnisch veränderte Mäuse und vom Menschen induzierte Neuronen, um die Rolle von MYT1L während der Entwicklung und als neue präklinische Plattform zur Untersuchung von MYT1L-assoziierten NDDs zu untersuchen. Mithilfe dieser Translationsmodelle zeigen wir, dass ein MYT1L-Mangel ausreicht, um Autismus-assoziierte Phänotypen zu induzieren, die von der Deregulierung der Genexpression und verzögerter Neurogenese bis hin zu kortikaler Ausdünnung und verändertem Verhalten reichen. MYT1L-Zielgene, einschließlich WNT- und NOTCH-Regulatoren, wurden früh nach der MYT1L-Depletion in menschlichen Neuronen aktiviert, und die Hemmung des chemischen Signalwegs könnte damit verbundene Differenzierungsdefekte beheben. Wir fanden heraus, dass der Verlust von MYT1L auch eine Hochregulierung nicht-neuronaler Gene, einschließlich des kardialen Natriumkanals SCN5A, verursachte und eine unerwartete Hyperaktivität des neuronalen Netzwerks auslöste, die durch MYT1L-Überexpression oder SCN5A-Knockdown behoben werden kann. Darüber hinaus rettete die akute Anwendung des zugelassenen Arzneimittels Lamotrigin die elektrophysiologischen Phänotypen in postmitotischen Maus- und menschlichen Neuronen sowie die Verhaltensphänotypen bei erwachsenen Mäusen und eröffnete so einen potenziellen therapeutischen Weg für Patienten mit MYT1L-Syndrom.

Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurden keine statistischen Methoden verwendet. Alle Werte, einschließlich Replikate und statistischer Analysen, sind in den Ergänzungstabellen S2–8, 13 verfügbar. Zellen für die In-vitro-Analyse wurden zufällig ausgewählt und Mäuse wurden zufällig den Behandlungsgruppen zugeordnet. Die Forscher waren für Patch-Clamp-Aufzeichnungen verblindet, andere Experimente waren nicht randomisiert.

Um den MYT1L-Verlust zu modellieren, erzeugten wir eine Keimbahnmutation in Mäusen, die einen Frameshift von 7 bp im Myt1l-Exon 6 aufwies. Darüber hinaus konstruierten wir ein bedingtes heterozygotes MYT1L-Allel in menschlichen ESCs, was die durch Cre vermittelte Entfernung von Exon 7 in menschlichen Neuronen ermöglichte. Wir beobachteten die erwartete Reduktion des MYT1L-Proteins voller Länge in Neuronen von Menschen und Mäusen. In mutierten Mäusen fanden wir eine verkürzte MYT1L-Protein-Isoform, der die Kernlokalisierung und -funktion fehlte, was die Gültigkeit unserer Funktionsverlustmodelle bestätigte.

Eine Hemisphäre von P0-Mäusen wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und für jede MYT1L-Immunpräzipitation wie zuvor beschrieben verwendet [21]. Gebundene Proteine ​​wurden enzymatisch verdaut und Peptide wurden durch massenspektrometrische Analyse (Fusion Orbitrap; Thermo Fisher Scientific) analysiert.

Maus-Gliazellen wurden aus Vorderhirnen von Wildtyp-CD1 (Jackson Laboratories) bei P0 isoliert, wie hier beschrieben [21]. Für primäre neuronale Kulturen wurden der Hippocampus oder der Kortex von P0-Myt1l-Mutanten- oder Kontrollmauswelpen wie zuvor veröffentlicht isoliert (28). Zur Überexpression oder zum Knockdown wurden die Zellen am Tag in vitro 3 (DIV3) mit Lentivirus-kodierenden Konstrukten transduziert.

Die Erzeugung menschlicher Neuronen wurde bereits beschrieben [29]. Die WNT- und NOTCH-Hemmung wurde durch Ergänzung des Mediums von Tag 1 bis Tag 4 mit entweder 10 µM N-[N-(3,5-Difluorphenacetyl)-l-alanyl]-S-phenylglycin-t-butylester (DAPT; Sigma) durchgeführt. , 15 µM Tetrahydro-2-[4-(trifluormethyl)phenyl]-4H-thiopyrano[4,3-d]pyrimidin (XAV939; Santa Cruz) oder beides. Zur funktionellen Reifung wurden neuronale Zellen zusammen mit primären Mausglia auf Matrigel-beschichteten Deckgläsern oder PEI-Laminin-beschichteten MEA-Platten (Axion) ausgesät, wobei das Medium eine Woche lang alle zwei Tage gewechselt wurde. Die folgenden Medienwechsel wurden während der Dauer des Experiments alle 3–4 Tage durchgeführt.

Zeitlich schwangere Frauen erhielten bei E14,5 eine intraperitoneale Injektion von EdU (30 mg/kg Körpergewicht) (Life Technologies). Nach 20 Stunden wurden embryonale Gehirne entnommen. Die Q-Fraktionsanalyse folgte zuvor etablierten Praktiken [6]. Die Anzahl der TBR2+- und SOX2+-Zellen wurde in mittelkortikalen 265 µm breiten Segmenten mithilfe eines selbst entwickelten Fidschi-Makros bestimmt. Alle Quantifizierungen wurden an äquivalenten anteroposterioren Positionen zwischen den Genotypen durchgeführt.

Zur Analyse der kortikalen Dicke wurden P0-Gehirnschnitte über Genotypen hinweg ausgerichtet, wobei subkortikale anatomische Orientierungspunkte zur Orientierung verwendet wurden, und die Dicke wurde in einem 45°-Winkel von der dorsalen Mittellinie gemessen. Die Morphologieanalyse kultivierter Neuronen wurde mit Fidschi unter Verwendung des SNT-Plugins durchgeführt (30, 31). Die nukleare FLAG-MYT1L-Lokalisierung wurde in primären Mausneuronen bei DIV 11 nach Überexpression der angegebenen Konstrukte bei DIV 3 durchgeführt.

Die Mäuse wurden in einem temperaturkontrollierten Vivarium mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten und die Tests wurden während des Lichtzyklus durchgeführt. Die Verfahren wurden am Interdisziplinären Neurobehavioralen Zentrum der Universität Heidelberg durchgeführt und vom Regierungspräsidium in Karlsruhe genehmigt (G-287/20, G-105/16).

RNA-Sequenzierungsbibliotheken wurden nach dem dUTP-Protokoll erstellt (32), und die Lesevorgänge wurden mit STAR (33) auf hg38 oder mm10 abgebildet. Die differenzielle Expression wurde mit DESeq2 (34) (R-Paketversion 1.28.1) mit Größenfaktornormalisierung und Wald bestimmt Signifikanztests. Für Einzelzell-RNA-Seq-Experimente wurden präfrontale Kortizes von P0-Mäusen extrahiert, in einzelne Zellen dissoziiert und nach dem ECCITE-Seq-Schema [35] und einem zuvor veröffentlichten Protokoll [36] mit einem Barcode versehen. Für die Bibliotheksvorbereitung wurde das Chromium Single Cell 5' v1 Reagenzienkit verwendet. Bibliotheken wurden mit einem NovaSeq 6000 (Illumina) sequenziert. Die Daten wurden mit 10x Genomics Cell Ranger (Version 4.0.0) [37], Seurat (Version 4.0) [38] und Scanpy (Version 1.6.0) [39] analysiert. Subpopulationen jedes Zelltyps, der am stärksten von der Myt1l-Mutation betroffen ist, wurden mithilfe von MELD (Version 1.0) (40) mit den Parametern Beta = 31 und KNN = 5 identifiziert. Signifikante Änderungen in den Zelltypverhältnissen wurden mithilfe einer Bootstrapping-Methode (41) basierend auf normalisierten Zellen identifiziert Zahlen (FDR < 0,01 und abs(Log2FC) > 1). Für diese Teilpopulationen wurde ein differenzieller Ausdruck mit MAST (Version 1.16.0) [42] innerhalb der FindMarkers-Funktion von Seurat durchgeführt (logfc.threshold = 0, min.pct = 0,05, alle anderen Parameter standardmäßig). Sequenzierungslesungen sind auf NCBI GEO GSE171327 verfügbar.

Der präfrontale Kortex von E18.5-, P0- und 3 Monate alten Mäusen wurde präpariert und einzelne Zellen wurden gemäß dem Protokoll für die Primärkulturvorbereitung präpariert. Für CUT&RUN wurden gemäß veröffentlichten Protokollen 300.000 Zellen pro Tier verwendet [43]. Bibliotheken wurden mit dem NEBNext DNA Library Prep Kit vorbereitet und auf NextSeq 2000 (Illumina) sequenziert. Die Daten wurden mit der nf-core/cutandrun-Pipeline v1.0 (https://doi.org/10.5281/zenodo.5653535) analysiert. Homer findMotifsGenome.pl wurde auf den Peak-Dateien mit den Parametern -size −75,75 -mask -mknown und dem MYT1L-Motiv AAAGTTW (http://homer.ucsd.edu/homer/) ausgeführt.

4–6 Wochen alte Mäuse wurden verwendet, um Hippocampusschnitte zu erzeugen und zu durchqueren, die wie zuvor beschrieben geflickt wurden [44]. Für spontane EPSC-Messungen wurden Pyramidenzellen mit einer K+-basierten internen Lösung, die Folgendes enthielt (in mM), auf –70 mV spannungsgeklemmt: 130 K-Gluconat, 10 Na-Gluconat, 10 HEPES, 10 Phosphokreatin, 4 NaCl, 4 MgATP, 0,3 GTP und 0,5 % Biocytin. Für spontane IPSC-Messungen wurden mutmaßliche Pyramidenzellen bei 0 mV mit einer internen Lösung auf Cs+-Basis spannungsgeklemmt, die Folgendes enthielt (in mM): 126 Cs-Gluconat, 4 Cs-Cl, 10 HEPES, 10 Phosphokreatin, 4 MgATP, 0,3 GTP und 2,5 QX-314 in Gegenwart von CNQX (10 μM) und D-APV (50 μM). Aufzeichnungen erregender synaptischer Ströme in primären Hippocampuskulturen bei DIV11 wurden wie hier beschrieben [21] in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,5 µM Tetrodotoxin (TTX) durchgeführt.

MEA-Messungen wurden mit dem Multiwell-Gerät Maestro Pro mit der Axis Navigator-Software und 48-Well-Platten (alle von Axion Biosystems) durchgeführt. Für akute Behandlungen wurden 10 µM Lamotrigin (Targetmol) pro Vertiefung hinzugefügt und die Platte wurde vor und 2 Stunden nach der Behandlung gemessen. Die Daten wurden mit meaRtools analysiert [45].

Um zu untersuchen, ob MYT1L-Mutationen komplexe neurologische Entwicklungsstörungen verursachen können, haben wir ein Mausmodell mit einer 7-bp-Deletion in Exon 6 von Myt1l erstellt (ergänzende Abbildung S1A – F). Diese Frameshift-Mutation induziert ein vorzeitiges STOP-Codon bei Aminosäure (aa) 78, ähnlich einem Patienten mit einer Nonsense-Mutation bei aa 75 im menschlichen MYT1L [15]. Die resultierenden Nachkommen zeigten im Vergleich zu (+/+)-Kontrollen eine erwartete Verringerung des MYT1L-Proteins in voller Länge (Abb. 1A und ergänzende Abb. S1G, H). Wir haben jedoch eine verkürzte MYT1L-Isoform entdeckt, die höchstwahrscheinlich von einem internen Methionin bei AA 99 exprimiert wird (Ergänzungsabbildung S1G, I) (Ergänzungstabelle S1). Diese Isoform konnte aufgrund des Fehlens des Kernlokalisierungssignals nicht in den Kern translozieren und ist daher voraussichtlich nicht funktionsfähig (ergänzende Abbildung S1J, K). Myt1l (+/–)-Mäuse sind lebensfähig und fruchtbar, aber die homozygote Myt1l (–/–)-Deletion führte zu postnataler Letalität (Abb. 1B). Dies zeigt, dass MYT1L überlebenswichtig ist und bestätigt unser Funktionsverlustmodell.

Die Konzentrationen eines MYT1L-Proteins in voller Länge in Gehirnlysaten von Mäusen, die eine CRISPR-induzierte 7-bp-Frameshift-Keimbahnmutation in Exon 6 (erstes proteinkodierendes Exon) von Myt1l nach der Geburt aufwiesen, normalisierten sich zur Kontrolle. Es werden repräsentative Western-Blot-Bilder mit den angegebenen Antikörpern gezeigt. n ≥ 6. B Überlebenskreisdiagramm von (+/−) x (+/−) Nachkommen bei der Geburt (8 Würfe P0; n = 12 (+/+, schwarz), 31 (+/−, blaugrün), 15 ( −/−, gelb)) und nach dem Absetzen (7 Würfe P21; n = 15 (+/+), 17 (+/−), 0 (−/−)) deuteten darauf hin, dass homozygote Myt1l-Mutanten nach der Geburt sterben. C Einzelzell-RNA-Seq des präfrontalen Kortex bei der Geburt und Wahrscheinlichkeit der Beobachtung einer MYT1L-defizienten (+/-) und Kontrollzellanreicherung (+/+) in Populationen spezifischer Zelltypen mithilfe von MELD. D Verhältnis von MYT1L-defizienten (+/-) und Kontrollzellen (+/+) in den angegebenen Zelltypen, kommentiert basierend auf Referenzdaten aus [77]. * FDR < 0,01 & abs(Log2FC) > 1. E Anzahl der Gene, die bei Myt1l (+/−)- und (−/−)-Mutation über die angegebenen Zelltypen und MELD-Cluster hinweg dereguliert wurden. Dargestellt sind Gene, die bei MYT1L-Mangel herunterreguliert (blau) oder hochreguliert (rot) sind, mit einer absoluten log2-fachen Änderung > 0,1 und p-adj < 0,05. F Genomweite Belegungsprofile von endogenem MYT1L im präfrontalen Kortex von Wildtyp-Mäusen, bestimmt durch CUT&RUN bei P0 (n = 3). G Kreisdiagramme zeigen die Verteilung der erkannten MYT1L-gebundenen Stellen in annotierten Genomregionen. H Das MYT1L-DNA-Bindungsmotiv (AAAGTT) ist an gebundenen Stellen deutlich angereichert. I Box-Plots der Genexpressionsänderungen im gesamten Genom (alle) und bei MYT1L-Zielgenen (CUT&RUN-Peak ± 5 kb von der Transkriptionsstartstelle) für angegebene Einzelzellpopulationen nach Myt1l-Deletion im Vergleich zur Kontrolle. Für scRNA-Seq n = 2 für Myt1l (−/−; 10503 Zellen), (+/−; 13688 Zellen) bzw. (+/+; 12072 Zellen). Balkendiagramm zeigt Mittelwerte, Datenpunkte einzelner Tiere werden angezeigt, Fehlerbalken = SEM, ungepaarter t-Test in Panel A, Mann-Whitney-Test in Panel I, ****p < 0,0001.

Um Veränderungen in der Zellzusammensetzung und Genexpression zu untersuchen, führten wir bei der Geburt eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) des präfrontalen Kortex durch (Abb. 1C – E und ergänzende Abb. S2) (Ergänzungstabelle S2). Wir haben keinen Verlust oder die Entstehung neuer Zellcluster beobachtet, aber wir haben Myt1l-Mutanten-spezifische Subpopulationen identifiziert, indem wir mithilfe von MELD die Wahrscheinlichkeit berechnet haben, dass sich jede Zelle in einer Nachbarschaft befindet, die entweder mit Kontroll- oder Mutantenzellen angereichert ist (40) (Abb. 1C und Ergänzung). Abb. S2C, D). Zwischen Mutanten- und Kontrollmäusen traten nur geringfügige Änderungen im Zelltypverhältnis auf (Abb. 1D und ergänzende Abb. S2E), wir fanden jedoch weniger Tbr2- und Sema3c-Zellpopulationen, die neu gebildete wandernde Neuronen in der subventrikulären Zone (SVZ) markieren. . Darüber hinaus waren Cdca7+-Interneuronen in (−/−) Mäusen reduziert, wohingegen Neuronen der kortikalen Schicht I (Reln+) erhöht waren. Die Analyse der unterschiedlich exprimierten Gene zeigte, dass die MYT1L-Depletion zu einer globalen Gen-Hochregulierung führte, die bei homozygoten Mutanten stärker ausgeprägt war (Abb. 1E). Wir beobachteten eine erhöhte Expression vieler nicht-neuronaler Genprogramme nach MYT1L-Depletion, sogar in Neuronen der kortikalen Schicht (ergänzende Abbildung S2F). Um MYT1L-Zielgene zu identifizieren, führten wir CUT&RUN [43] bei Wildtyp-Mäusen am embryonalen (E) Tag E18.5, postnatalen (P) Tag 0 (P0) und 3 Monaten (Erwachsener) durch (Abb. 1F, G und ergänzende Abb . S2G, H) (Ergänzungstabelle S3). Wir fanden eine große Überlappung gebundener Stellen und eine Anreicherung des MYT1L-DNA-Bindungsmotivs (AAAGTT) in verschiedenen Entwicklungsstadien (Abb. 1H und ergänzende Abb. S2I, J). Die Kreuzung von MYT1L-Zielgenen mit deregulierten Genen bei P0 ergab eine signifikante Hochregulierung innerhalb verschiedener neuronaler Populationen, wie z. B. der kortikalen Satb2- oder Fezf2-Zellpopulationen (Abb. 1I und ergänzende Abb. S2K). Dies unterstreicht die Rolle von MYT1L als Transkriptionsrepressor und legt nahe, dass Myt1l-mutierte Zellen trotz der Induktion der neuronalen Identität nicht in der Lage waren, ungeeignete Genexpressionsprogramme zum Schweigen zu bringen, was zu einer verwirrten Transkriptionsidentität in Neuronen in vivo führte.

MYT1L kann die neuronale Identität in vitro verbessern, indem es negative Regulatoren der Neurogenese [21] wie Notch und Wnt unterdrückt, die bei Fehlregulation die neuronale Differenzierungsdynamik und die Gehirnstruktur beeinflussen könnten. Daher führten wir neben der Co-Färbung des Proliferationsmarkers Ki67 eine EdU-Pulsverfolgung durch, um den Quittungsanteil (Q) der kortikalen Zellen zu bestimmen, die den Zellzyklus über einen Zeitraum von 20 Stunden verlassen. Tatsächlich waren die Ki67−EdU+-Zellen signifikant zurückgegangen, was einer Abnahme des Q-Anteils um ~37 % in Myt1l (-/-)-Embryonen bei E15,5 entspricht (Abb. 2A). SOX2+ neurale Stammzellen und TBR2+ neurale Vorläufer waren bei E15,5 unverändert (ergänzende Abbildung 3A). Bei der Geburt waren die SOX2+-Stammzellen in Myt1l (+/–)- und (–/–)-Mäusen erhöht (Abb. 2B), während sich die TBR2+-Vorläuferzellen nicht veränderten. Dies ahmt eine Überexpression des NOTCH-Effektors Hes1 nach, der den Stammzellpool nach der Geburt vergrößert und zu einem dünneren Kortex führt [46]. Daher untersuchten wir die Gehirnanatomie von Myt1l-mutierten Mäusen und stellten fest, dass die Gesamtgröße des Gehirns bei der Geburt unverändert blieb, während das Gehirngewicht geringer war, was zu einem erhöhten Verhältnis von Länge zu Gewicht führte (Abb. 2C und ergänzende Abb. S3B, C). Darüber hinaus waren die Kortizes ~10 % (+/–) bzw. ~15 % (–/–) dünner als bei den Kontrollen (Abb. 2C und ergänzende Abb. S3C). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Versäumnis, antineurogene Programme zu unterdrücken, die Neurogenese beeinträchtigte, was wiederum zu strukturellen Hirnanomalien führen und die bei einigen Patienten festgestellten Hirnfehlbildungen erklären könnte [19].

A Repräsentative Bilder und Quantifizierungen von EdU+-Zellen nach einem 20-stündigen Puls bei E14,5 und Q-Fraktion (Verhältnis von EdU+Ki67− zu allen EdU+-Zellen) in der kortikalen ventrikulären Zone (VZ) und subventrikulären Zone (SVZ) von Myt1l (+ /+, schwarz), (+/−, blaugrün) und (−/−, gelb) E15.5-Mäuse. IZ-Zwischenzone, n ≥ 5, Maßstabsbalken 100 µm. B Quantifizierung von SOX2+- oder TBR2+-Zellen im Kortex von Myt1l (+/−)- und (−/−)-Mäusen im Vergleich zur (+/+)-Kontrolle bei P0 über den gleichen Bereich des gesamten Kortex. Es werden repräsentative Bilder einer ventrikulären und subventrikulären Zonenvergrößerung gezeigt, die mit den angegebenen Antikörpern gefärbt sind. n ≥ 4, Maßstabsbalken 50 µm. C Struktur von Myt1l (+/+), (+/−) und (+/−) Gehirnen bei P0. Gezeigt werden repräsentative, mit NeuN gefärbte Schnitte und die Quantifizierung der absoluten Kortikalisdicke und Kortexlänge, normalisiert durch das Gehirngewicht. n ≥ 5 für die kortikale Länge; Abschnitte von n = 3 für kortikale Dicke, Maßstabsleiste 500 µm. Balkendiagramme zeigen Mittelwerte, Datenpunkte einzelner biologischer Replikate werden angezeigt, Fehlerbalken = SEM, einfaktorielle ANOVA *p < 0,05,**p < 0,01, ***p < 0,001.

Als nächstes untersuchten wir die Auswirkungen des MYT1L-Mangels auf molekularer Ebene über die gesamte Gehirnentwicklung hinweg unter Verwendung von Bulk-RNA-Seq von Maus-Kortexen bei E18,5 (zeitgleich mit der höchsten Myt1l-Expression im Mausgehirn (Ergänzende Abbildung S1A [11])), P0 (Geburt), P22 (Jugendlicher) und 3 Monate (Erwachsener). Wir fanden mehrere hundert unterschiedlich exprimierte Gene mit unterschiedlichen Clustern deregulierter Gene früh (E18.5 und P0) und spät (P22 und adult) in der Entwicklung (Abb. 3A und ergänzende Abb. S4A) (Ergänzungstabelle S4). Viele der deregulierten Gene überlappten nicht mit zuvor annotierten MYT1L-Zielen (21) oder den MYT1L CUT & RUN-Zielen (Abb. 1F und ergänzende Abb. S2G), was darauf hindeutet, dass viele Änderungen in Massenproben indirekt sind. In heterozygoten Gehirnproben wurden die MYT1L-Zielgene sowohl hoch- als auch herunterreguliert, dennoch wurden etwa 60 % der direkten MYT1L-Zielgene bei homozygoter Myt1l-Mutation hochreguliert (ergänzende Abbildung S4B). Dies steht im Einklang mit der Hochregulierung der MYT1L-Zielgene in (+/–) und (–/–) kortikalen Neuronen basierend auf Einzelzellanalysen (Abb. 1E), was darauf hindeutet, dass MYT1L während der neuronalen Entwicklung vorwiegend als Repressor fungiert. In Übereinstimmung mit der verringerten Q-Fraktion bei E15.5 zeigte die Genexpression bei E18.5 eine Herunterregulierung der mit der Neurogenese assoziierten GO-Terme und eine Hochregulierung der Zellteilung (Abb. 3B). Darüber hinaus beobachteten wir eine Hochregulierung der frühen fetalen Genexpressionssignaturen und eine damit einhergehende Abnahme der späten fetalen Signaturen bei E18,5 [47] (Abb. 3C und ergänzende Abb. S4D). Dies deutet darauf hin, dass ein MYT1L-Mangel, wie er in anderen ASD-Mausmodellen beobachtet wurde [5], zu Verzögerungen in der Gehirnentwicklung führt. Wir beobachteten eine anhaltende Herunterregulierung neuronaler GO-Terme und einen Anstieg der Signal- und nicht-neuronalen Terme bei Myt1l-Mutation bei erwachsenen Mäusen (Abb. 3B und ergänzende Abb. S4C). Die Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) zeigte mehrere nicht-neuronale Zellschicksalsignaturen unter den hochregulierten Genen auf und zeigte eine allgemeine Anreicherung von Genen, die an Epilepsie, Schizophrenie und ASD beteiligt sind, unter den deregulierten Genen in Myt1l-mutierten Gehirnen [48, 49] ( Ergänzende Abbildung S4D, E). Interessanterweise zeigten Mäuse, die unsere Myt1l-Exon-6-Mutation trugen, eine Hoch- und Herunterregulierung des Gens, die mit Chd8-haploinsuffizienten Mäusen überlappte [6], jedoch nur teilweise mit kürzlich veröffentlichten Myt1l-mutierten Mäusen mit Exon 15 [26] und Exon 9 [27] (Ergänzende Abb . S4F). Schließlich entdeckten wir, dass bei ASD-Patienten hochregulierte Gene auch bei unseren MYT1L-defizienten Mäusen hochreguliert sind, während bei Myt1l-mutierten Mäusen herunterregulierte Gene auch bei ASD-Patienten herunterreguliert sind (5, 50) (Abb. 3D und ergänzende Abb. S4G). Insgesamt zeigen unsere Daten, dass ein MYT1L-Mangel bei Mäusen zu Verzögerungen in der neurologischen Entwicklung und einer Deregulierung der Genexpression führt, wie sie bei ASD-Patienten beobachtet werden.

Eine Heatmap deregulierter Gene bei Myt1l-Mutation über alle Replikate und Stadien hinweg, skaliert nach Gen (Zeilen). B Ausgewählte Begriffe der Top-Gen-Ontologie (GO) und p-Werte von Genen, die bei der Myt1l-Mutation im Cortex von Mäusen im Vergleich zur Kontrolle zu angegebenen Zeitpunkten während der Entwicklung herunterreguliert (blau) oder hochreguliert (rot) waren. C GSEA-Diagramme zeigen die Erschöpfung der mittelfötalen (blau) und die Anreicherung der frühfötalen (rot) neuralen entwicklungsbezogenen Gensätze unter den Genen, die in Myt1l-mutierten Gehirnen bei E18.5 dereguliert wurden. NES, normalisierter Anreicherungsscore; FDR, Falscherkennungsrate. D Überlappung von Genen, die durch Myt1l-Mutation im Mauskortex bei E18.5 und P22 hoch- oder herunterreguliert werden, und Genen, die in Gehirnen von ASD-Patienten hoch- oder herunterreguliert werden, bestimmt durch GeneOverlap. Für RNA-Seq-Analyse n ≥ 5 E18.5, n ≥ 4 P0 für (+/+, schwarz), (+/−, blaugrün) bzw. (−/−, gelb); n = 6 P22, n ≥ 3 Erwachsene für (+/+) bzw. (+/−). E Der Freilandtest zeigte, dass Myt1l (+/−)-Mutanten im Vergleich zu Kontrolltieren bei P23 eine größere Distanz zurücklegten und mehr Zeit in zentralen Regionen verbrachten; n = 25 für (+/+) und n = 29 für (+/−) aus drei unabhängigen Kohorten. F Soziale Kammerexperimente zeigten im Vergleich zu Kontrollmäusen im Alter von einem Monat eine männerspezifische Verkürzung der Zeit, die Myt1l (+/−)-Mutanten für die Erforschung einer neuen Maus aufwendeten; n = 10 für (+/+) und (+/−) aus drei unabhängigen Kohorten. Balkendiagramme zeigen Mittelwerte, Datenpunkte einzelner Tiere werden angezeigt, Fehlerbalken = SEM, Mann-Whitney-Test **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, NS nicht signifikant.

Als nächstes führten wir Verhaltensanalysen mit unserem Myt1l-Mausmodell durch. Wir beobachteten einen Trend zu einer verstärkten Lautäußerung bei Mäusen mit MYT1L-Mangel im frühen postnatalen Stadium, die Anzahl und Art der analysierten Rufe änderten sich jedoch nicht wesentlich (ergänzende Abbildung S5A). In Übereinstimmung mit Hyperaktivitätsphänotypen, die bei mehreren MYT1L-Patienten berichtet wurden [13, 14, 15, 16, 51, 52], beobachteten wir eine erhöhte Fortbewegung bei erwachsenen Mäusen in ihren Heimkäfigen sowie bei jugendlichen Mäusen im Freiland und im erhöhten Plus-Labyrinth Tests (Abb. 3E und ergänzende Abb. S5B – D). Mutierte Mäuse verbrachten in den beiden letztgenannten Tests etwa 70 % mehr Zeit in zentralen Regionen und offenen Armen. Darüber hinaus war das explorative Aufzuchtverhalten bei mutierten Mäusen signifikant erhöht (Ergänzende Abbildung S5D). Dies weist darauf hin, dass Mäuse mit MYT1L-Mangel weniger ängstlich sind, ein Phänotyp, über den in anderen ASD-Mausmodellen berichtet wurde (53, 54). Wir beobachteten auch einen signifikanten Rückgang der Marmorvergrabungs- und -pflegeereignisse, die zur Bewertung sich wiederholender Verhaltensweisen verwendet werden, aber auch eine Verringerung angstähnlicher Verhaltensweisen darstellen (ergänzende Abbildung S5D, F). Abschließend wurden Sozialkammerexperimente durchgeführt, um das Sozialverhalten unserer Myt1l-mutierten Mäuse zu untersuchen. Alle Tiere zeigten die erwartete Präferenz für die Untersuchung von Kammern mit einem vertrauten Wurfgeschwister im Gegensatz zu leeren Kammern. Während jedoch sowohl Wildtyp- als auch weibliche Myt1l-mutierte Mäuse mehr Zeit damit verbrachten, die Kammer mit einer neu hinzugefügten unbekannten Maus zu erkunden, zeigten MYT1L-defiziente Männchen nicht die erwartete Präferenz für soziale Neuheiten (Abb. 3F und ergänzende Abb. S5E). Zusammenfassend führt die Myt1l-Depletion in Tests zur Modellierung von ASD-bedingtem Verhalten zu mehreren auffälligen Verhaltensänderungen, darunter Hyperaktivität, die bei männlichen und weiblichen Mäusen festgestellt wurde, und männliche spezifische soziale Defizite.

Um die Rolle von MYT1L in menschlichen Neuronen zu untersuchen, haben wir menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) mit einem heterozygoten bedingten Knockout-Allel von MYT1L Exon 7 (+/fl) entwickelt (Abb. 4A und ergänzende Abb. S6). MYT1L (+/fl) hESCs wurden mittels NGN2-Transkriptionsfaktor-vermittelter Differenzierung auf elektrisch reife menschliche Neuronen gerichtet [29]. Dies ermöglicht die bedingte Untersuchung von Entwicklungs- und synaptischen Prozessen im Zusammenhang mit neurologischen Störungen [55,56,57]. Die durch Cre vermittelte Deletion von MYT1L (+/-) führte zu einer Proteinreduktion von etwa 50 % und imitierte damit die bei Patienten festgestellte MYT1L-Haploinsuffizienz (Abb. 4B, ergänzende Abb. S6G). Zunächst untersuchten wir die Transkriptionseffekte der MYT1L-Depletion im Vergleich zu Δcre-transduzierten isogenen Kontrollen zu frühen und späten Reifungszeitpunkten (Ergänzungstabelle S5). MYT1L-mutierte Neuronen zeigten eine Abnahme der neuronalen GO-Terme und eine Anreicherung der an Epilepsie, Schizophrenie und ASD beteiligten Gene unter den deregulierten Genen (48, 49) (Abb. 4C und ergänzende Abb. S7A). Mit unterschiedlich hochregulierten Genen verbundene GO-Begriffe überlappten sich stark zwischen unseren Maus- und Humanmodellen (Ergänzungsabbildung 7B) (Ergänzungstabelle S6), was auf konservierte Effekte hinweist. Insgesamt führte die MYT1L-Depletion zu einer stärkeren Genaktivierung früh (Woche 1) und spät (Woche 6) nach der neuronalen Induktion (Abb. 4D und ergänzende Abb. S7C). Das MYT1L-DNA-Bindungsmotiv (AAAGTT) wurde an Genen angereichert, die nach MYT1L-Depletion hochreguliert wurden (Abb. 4E und ergänzende Abb. S7D, E). Mehrere Transkriptionsfaktoren, die das Schicksal nicht-neuronaler Zellen regulieren, wie das mesodermspezifische PRRX1 oder der Glia-Schalter-Regulator SOX9 (58, 59), enthalten MYT1L-Motive und wurden in MYT1L-defizienten Neuronen hochreguliert (Abb. 4F). GSEA ergab eine Hochregulierung nicht-neuronaler Genexpressionsprogramme, wie z. B. des Schicksals von Muskelzellen, nach MYT1L-Depletion (ergänzende Abbildung S7F). Die Ingenuity Pathway Analysis (IPA) bestätigte, dass unangemessene Entwicklungsprogramme wie Myogenese und Kardiogenese nach der MYT1L-Mutation aktiviert wurden, was darauf hindeutet, dass sie durch MYT1L kontinuierlich unterdrückt werden (Abb. 4G und ergänzende Abb. S7G). Andererseits zeigten neuronale Transkriptionsfaktoren wie VAX2 oder EN1, die keine MYT1L-Motive in ihrem Promotor enthalten, nach einer Woche eine verringerte Expression, zeigten jedoch im Vergleich zu den Kontrollen nach sechs Wochen eine unerwartet erhöhte Expression (Abb. 4F). Dieses Expressionsmuster spiegelte sich in Signalwegen wider, die an der neuronalen Differenzierung und Funktion beteiligt sind, einschließlich Synaptogenese und Kalziumsignalisierung, die zunächst unterdrückt wurden, später jedoch in MYT1L-defizienten Neuronen zunahmen (Abb. 4G und ergänzende Abb. S7G). Wichtig ist, dass unsere Erkenntnisse zur Deregulierung neuronaler Gene in Neuronen zusammengefasst wurden, die von einem weiteren unabhängig entwickelten MYT1L (+/fl) hESC-Klon abgeleitet waren (ergänzende Abbildungen S6 und S7). Überraschenderweise hatte die Verzögerung der neuronalen Genexpression keinen Einfluss auf die Neuronenkomplexität nach zehn Tagen oder sechs Wochen induzierter Neurogenese (ergänzende Abbildung S8). Während der neuronalen Neuprogrammierung von Mausfibroblasten förderte MYT1L das Schicksal der Neuronen, indem es antineurogene Gene wie Id3 sowie Mitglieder des WNT- und NOTCH-Signalwegs unterdrückte [21]. Hier beobachteten wir eine erhöhte Expression dieser Gene in MYT1L-defizienten menschlichen Neuronen während der neuronalen Induktion (Abb. 4F). Durch die kombinierte Anwendung chemischer Inhibitoren, die auf die WNT- und NOTCH-Signalwege abzielen, wurden die Kontrollwerte des TUJ1-Proteins wiederhergestellt und die Genexpressionsänderungen in MYT1L-Mutanten basierend auf RNA-Seq-Messungen teilweise normalisiert, insbesondere durch Verringerung der Expression von Genen, die bei MYT1L-Depletion hochreguliert werden (Abb. 4H und). Ergänzende Abbildung S9A, B) (Ergänzende Tabelle S7). Darüber hinaus haben wir mehrere proneuronale Transkriptionsfaktoren identifiziert, die normalerweise früh während der induzierten Neurogenese ihren Höhepunkt erreichen und in MYT1L-mutierten Neuronen in der ersten Woche herunterreguliert, in der sechsten Woche jedoch hochreguliert wurden (ergänzende Abbildung S9C). Die Expression dieser Faktoren konnte in MYT1L-defizienten Neuronen durch WNT- und NOTCH-Hemmung in Woche eins normalisiert werden (ergänzende Abbildung S9D). Insgesamt deutet dies darauf hin, dass die heterozygote Deletion von MYT1L während der vom Menschen induzierten Neurogenese zu einer Deregulierung von Autismus-assoziierten Genen und einer Aktivierung nicht-neuronaler Zielgene führt, was zu Verzögerungen bei der Neurogenese führt, die zumindest teilweise durch erhöhte WNT- und NOTCH-Signale vermittelt werden.

Ein Schema der bedingten heterozygoten MYT1L-Deletion während der Transkriptionsfaktor-vermittelten induzierten menschlichen Neurogenese. B Western-Blot-Quantifizierung der Zellen 7 Tage (1 Woche) nach der Induktion der Neurogenese normalisierte sich auf die Kontrolle. Es werden repräsentative Western-Blot-Bilder mit den angegebenen Antikörpern gezeigt. n = 3. C Deregulierte Gene in MYT1L-mutierten Neuronen 43 Tage (6 Wochen) nach der auf die Kontrolle normalisierten Induktion der Neurogenese zeigten eine signifikante Überlappung mit Genen, die mit Epilepsie, Schizophrenie und ASD verbunden sind, bestimmt durch den exakten Fisher-Test. D Vulkandiagramm unterschiedlich exprimierter Gene in MYT1L-depletierten menschlichen Neuronen nach einer Woche Reifung im Vergleich zu isogenen Kontrollen. Hervorgehoben sind Gene, die nach der MYT1L-Depletion herunterreguliert (blau) oder hochreguliert (rot) wurden, mit einer absoluten log2-fachen Änderung > 0,2 und p-adj < 0,1. E Das MYT1L-DNA-Bindungsmotiv AAAGTT war bei hochregulierten Genen in Panel D signifikant angereichert. F Ausgewählte deregulierte Gene bei MYT1L-Depletion werden als Faltveränderung nach unten (blau) oder hochreguliert (rot) im Vergleich zur isogenen Kontrolle und der jeweiligen Anzahl der MYT1L-Motive angezeigt Promoter wird angezeigt. BE zeigt Daten für repräsentativen Klon 1 an. G Ingenuity Pathway Analysis (IPA) von differentiell exprimierten Genen in MYT1L-depletierten menschlichen induzierten Neuronen. Der Zustand der Aktivierung (rot) oder Hemmung (blau) eines Signalwegs oder einer biologischen Funktion wird durch einen Z-Score (rechtsseitiger exakter Fisher-Test) dargestellt. Die Ergebnisse werden für zwei Klone angezeigt, 1 und 6 Wochen nach der Transkriptionsfaktor-vermittelten induzierten menschlichen Neurogenese. n = 4 (Klon 1) oder n = 5 (Klon 2) für (+/fl) bzw. (+/−). H Reduzierte TUJ1-Proteinspiegel in MYT1L-depletierten induzierten menschlichen Neuronen am Tag 7 können durch WNT- und NOTCH-Hemmung über XAV939 und DAPT mit n = 4 (Klon 1) wiederhergestellt werden. Balkendiagramme zeigen Mittelwerte, Datenpunkte einzelner biologischer Replikate werden angezeigt, Fehlerbalken = SEM, ungepaarter t-Test in Panel B und H, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Um zu untersuchen, ob die MYT1L-Haploinsuffizienz die neuronale Funktion in menschlichen Zellen beeinflusst, untersuchten wir die elektrophysiologischen Eigenschaften von MYT1L (+/−)-Neuronen auf Bevölkerungsebene nach sechswöchiger Reifung unter Verwendung eines Multi-Elektroden-Arrays (MEA) [60, 61]. Unerwarteterweise beobachteten wir, dass sich das Spike-Firing in menschlichen MYT1L-mutierten Neuronen im Vergleich zu Kontrollen verdoppelte und die gleichzeitige Netzwerk-Fire-Aktivität verdreifachte (Abb. 5A). Die veränderte elektrophysiologische Aktivität korrelierte direkt mit dem Abbau des MYT1L-Proteins, trat bereits drei Wochen nach der neuronalen Induktion auf und blieb bis zum Ende eines Langzeitexperiments in Woche 15 bestehen (Ergänzende Abbildung S10A – C). Der elektrophysiologische Phänotyp konnte in einem unabhängig entwickelten MYT1L (+/fl) hESC-Klon rekapituliert werden (ergänzende Abbildung S10D). Als nächstes testeten wir, ob diese funktionellen Veränderungen in primären Mausneuronen erhalten blieben. Zu diesem Zweck untersuchten wir mithilfe von MEA die elektrophysiologischen Eigenschaften kultivierter Hippocampus-Neuronen, die von Myt1l-Mutanten- und Kontrollmäusen stammen. Als wir unsere Erkenntnisse in menschlichen MYT1L (+/-)-Neuronen zusammenfassten, beobachteten wir ein erhöhtes Feuern und eine erhöhte Netzwerkhyperaktivität. Diese Effekte skalierten mit der MYT1L-Depletion, mit einem durchschnittlichen Anstieg der Spitzenfeuerung von ~700 % (–/–) und ~400 % (+/–) im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 5B und ergänzende Abb. S11A). Bemerkenswert ist, dass die Überexpression von MYT1L99-1187 in Wildtyp-Neuronen die elektrophysiologische Aktivität auf MEA nicht veränderte, was einen möglichen dominanten negativen Effekt der verkürzten MYT1L-Isoform ausschließt, was weiter bestätigt, dass es sich bei unseren Myt1l-mutierten Mäusen um ein Modell mit Funktionsverlust handelt (ergänzende Abb . S11B). Eine erhöhte MEA-Feueraktivität konnte auch in primären Neuronen beobachtet werden, die aus Kortizes von Mäusen mit MYT1L-Mangel bei der Geburt stammten, was darauf hindeutet, dass Defekte nicht auf bestimmte Gehirnregionen beschränkt sind, sondern mindestens zwei Bereiche betreffen, die an ASD beteiligt sind (62) (Ergänzende Abbildung S11C). ). Um die beobachtete Netzwerkhyperaktivität mit der synaptischen Aktivität einzelner Zellen zu korrelieren, führten wir Patch-Clamp-Aufzeichnungen durch. Im Einklang mit der beobachteten Netzwerkhyperaktivität waren die Amplitude und Häufigkeit spontaner erregender postsynaptischer Ströme (EPSCs) und Miniatur-EPSCs (mEPSCs; aufgezeichnet in Gegenwart von Tetrodotoxin (TTX)) in kultivierten primären Mausneuronen mit MYT1L-Mangel erhöht (ergänzende Abbildung). . S11D, E). Wie im menschlichen Modell konnten wir keine signifikanten Veränderungen in der neuronalen Morphologie kultivierter primärer Neuronen mit MYT1L-Mangel beobachten (ergänzende Abbildung S11F). Wir führten auch elektrophysiologische Hirnschnittaufzeichnungen von Pyramidenneuronen durch, die sich in der CA1-Region des Hippocampus von ein Monat alten Mäusen befinden. In Übereinstimmung mit unseren In-vitro-Daten beobachteten wir eine erhöhte spontane EPSC-Häufigkeit bei Myt1l-Mutanten im Vergleich zu Kontrollen (Abb. 5C). Intrinsische Eigenschaften wie das Ruhemembranpotential und die Merkmale des evozierten Aktionspotentials schienen unverändert (ergänzende Abbildung S12A). Die Häufigkeit spontaner inhibitorischer postsynaptischer Ströme (sIPSCs, aufgezeichnet in Gegenwart von CNQX und D-APV) war in MYT1L-defizienten Pyramidenneuronen erhöht, was darauf hinweist, dass die erhöhte Erregung nicht auf eine verminderte Hemmung zurückzuführen ist (ergänzende Abbildung S12B). Unsere Experimente zeigen, dass eine kontinuierliche MYT1L-Depletion die neuronale Funktion beeinträchtigt und zu einem unerwarteten elektrophysiologischen Hyperaktivitätsphänotyp in Neuronen von Menschen und Mäusen führt.

A Erhöhte spontane neuronale Netzwerkaktivität, gemessen durch Multi-Elektroden-Array (MEA) in MYT1L-defizienten (+/−; blaugrünen) Neuronen im Vergleich zur Kontrolle (+/fl, schwarz) 6 Wochen nach der induzierten Neurogenese. Es werden repräsentative Rasterdiagramme sowie Spike- und Netzwerk-Spike-Quantifizierungen angezeigt. B Netzwerkhyperaktivität, gemessen durch MEA für Kontroll- (+/+, schwarz) und mutierte Myt1l-Neuronen (+/–; blaugrün und –/–; gelb) Hippocampus-Neuronen in Kultur am Tag in vitro 11 (DIV11). Es werden repräsentative Rasterdiagramme und Quantifizierungen angezeigt. C Erhöhte spontane erregende postsynaptische Ströme (sEPSCs) von CA1-Pyramidenneuronen in akuten Gehirnschnitten von Mäusen. Repräsentative Spuren, Quantifizierung und kumulative Verteilungen werden angezeigt, Balkendiagramme zeigen Mittelwerte mit der Anzahl der gepatchten Zellen oder MEA-Vertiefungen aus den angegebenen biologischen Replikaten an, Fehlerbalken = SEM, Mann-Whitney-Test in Panel A und C, einfaktorielle ANOVA in Panel B, *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Wir beobachteten ähnliche elektrophysiologische Netzwerk-Hyperaktivitätsphänotypen basierend auf MEA-Messungen in primären Maus- und Stammzellen-abgeleiteten menschlichen induzierten Neuronen bei MYT1L-Mutation, was auf einen konservierten zugrunde liegenden molekularen Mechanismus hinweist. Da in Menschen- und Mausmodellen die Aktivierung nicht-neuronaler Zielgene bei MYT1L-Mutation beobachtet wurde, könnte dies zu den überlappenden Phänotypen beitragen. Um solche Ziele zu identifizieren, analysierten wir Gene, die: (i) in vivo an MYT1L gebunden wurden, wie durch CUT & RUN bestimmt (Abb. 1F und ergänzende Abb. S2G) (Ergänzungstabelle S3); (ii) wurden in primären von Mäusen oder Menschen induzierten Neuronen nach heterozygoter MYT1L-Deletion, bestimmt durch RNA-Seq, dereguliert (Ergänzungstabellen S5 und 8); (iii) trug zur Hochregulierung nicht-neuronaler Begriffe auf der Grundlage von IPA bei (Abb. 4 und ergänzende Abb. S4 und 7); und (iv) wurden im Gehirn im Vergleich zu anderen Geweben nur schwach exprimiert, basierend auf öffentlichen Expressionsdatensätzen [63]. Bemerkenswerterweise wurden 78 % (30 von 38) dieser nicht-neuronalen Ziele nach MYT1L-Depletion in Maus- und menschlichen Neuronen hochreguliert (Abb. 6A und ergänzende Abb. S13A). Das am häufigsten hochregulierte Ziel ist TFAP2B, das bei Mutation das Char-Syndrom verursachen kann, das durch Gesichts-, Gang- und Handanomalien gekennzeichnet ist [64]. Interessanterweise weisen einige Patienten mit MYT1L-Mutationen leichte Gesichtsdysmorphien auf [19, 65]. Darüber hinaus fanden wir unter den Top 10 der hochregulierten Zielgene einen fast zweifachen Anstieg des kardialen spannungsgesteuerten Natriumkanals SCN5A, der bei Mutation ein langes QT-Syndrom verursachen kann [66]. SCN5A zeigte eine niedrige Basalexpression in Neuronen von Menschen und Mäusen, und eine erhöhte Expression in MYT1L-defizienten Neuronen könnte die elektrophysiologischen Eigenschaften verändern. MYT1L bleibt in reifen Neuronen exprimiert, was darauf hindeutet, dass es auch in postmitotischen Neuronen funktioniert (ergänzende Abbildung S1A). Wir fragten daher, ob die Myt1l-Überexpression (OE) in postmitotischen MYT1L-defizienten Neuronen die Unterdrückung von Zielgenen wie Scn5a wiederherstellen könnte. Myt1l OE erhöhte die Expression des neuronalen Markers Tuj1 im Vergleich zu GFP-OE-Kontrollen signifikant (Abb. 6B und ergänzende Abb. S13B, C). Wichtig ist, dass Myt1l OE die Expression von Zielgenen verringerte, die in MYT1L-mutierten Neuronen hochreguliert waren, insbesondere Hes1 und Scn5a (Abb. 6C). Bemerkenswerterweise stellten wir fest, dass Myt1l OE auch die Aktivität des neuronalen Netzwerks auf Kontrollniveau wiederherstellte (Abb. 6D). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die kontinuierliche Deregulierung der Genexpression in postmitotischen Neuronen, die durch die MYT1L-Mutation verursacht wird, zu elektrophysiologischen Hyperaktivitätsphänotypen beiträgt und dass diese auch nach Abschluss der Neuroentwicklung wiederhergestellt werden könnten. Um zu testen, ob die SCN5A-Hochregulation den elektrophysiologischen Hyperaktivitätsphänotyp verursacht, führten wir einen shRNA-vermittelten SCN5A-Knockdown sowohl in primären als auch menschlichen induzierten Neuronen der Maus durch, wodurch die SCN5A-Spiegel um 80 % gesenkt wurden, und maßen die neuronale Netzwerkaktivität mithilfe von MEA (ergänzende Abbildung S13D). Bemerkenswerterweise reduzierte der Scn5a-Knockdown die Hyperaktivität des neuronalen Netzwerks in (+/−) und (−/−) primären Neuronen der Maus auf Wildtypniveau (Abb. 6E). Dies könnte durch SCN5A-Knockdown in MYT1L (+/-) menschlichen induzierten Neuronen rekapituliert werden (Abb. 6G), was darauf hindeutet, dass die Hochregulierung von SCN5A zumindest teilweise zur Hyperaktivität des elektrophysiologischen Netzwerks in MYT1L-mutierten Neuronen von Mäusen und Menschen beiträgt. Um eine mögliche therapeutische Intervention zu finden, beschlossen wir zu testen, ob Lamotrigin, ein Natriumkanalblocker und von der FDA zugelassenes Antiepileptikum [67, 68], durch MYT1L-Mangel verursachte Phänotypen retten kann. Tatsächlich normalisierte die akute Anwendung von Lamotrigin die Hyperaktivität des elektrophysiologischen Netzwerks von MYT1L-defizienten Neuronen sowohl beim Menschen als auch bei der Maus gegenüber Kontrollniveaus (Abb. 6F, H). Um schließlich zu untersuchen, ob die Hyperaktivität des neuronalen Netzwerks zu den Verhaltensphänotypen beiträgt, die bei der Myt1l-Mutation beobachtet werden, und um zu testen, ob diese auch für pharmakologische Eingriffe in vivo geeignet sind, injizierten wir Mäusen Lamotrigin. Wir fanden heraus, dass eine akute Lamotrigin-Behandlung bei Myt1l-mutierten Mäusen das Angst- und Hyperaktivitätsverhalten im Freilandtest sowie die Fortbewegung und Aufzucht in Heimkäfigbeobachtungen gegenüber unbehandelten Kontrollmäusen normalisierte (Abb. 6I und ergänzende Abb. S13E). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die MYT1L-Mutation neben neurologischen Entwicklungsdefekten auch eine Hochregulierung nicht-neuronaler Gene und eine Hyperaktivität neuronaler Netzwerke in Maus- und menschlichen Neuronen verursacht. Eine akute Behandlung mit Lamotrigin in postmitotischen Neuronen und erwachsenen Mäusen rettete sowohl die Hyperaktivität des elektrophysiologischen Netzwerks als auch die getesteten Verhaltensphänotypen (Abb. 6J), was darauf hindeutet, dass elektrophysiologische Effekte zumindest teilweise zu verändertem Verhalten bei Mäusen beitragen. Daher beeinflusst die MYT1L-Mutation nicht nur die Entwicklung, sondern auch die neuronale Funktion und das Verhalten im Erwachsenenalter, was darauf hindeutet, dass gezielte Behandlungen auch Patienten in späteren Entwicklungsstadien zugute kommen können.

A Deregulierte nicht-neuronale MYT1L-Zielgene in MYT1L-defizienten menschlichen Neuronen (Woche 6) und primären Mausneuronen am Tag in vitro 11 (DIV11) umfassen den kardialen Natriumkanal SCN5A. Die Deregulierung der Genexpression basierend auf RNA-Seq wird als fache Veränderung im Vergleich zur Kontrolle angezeigt, n = 4 (Mensch) für (+/fl) und (+/−), n = 3 (Maus) für (+/+) und (+/-). Gewebeexpressionsdaten vom GTEx-Portal werden als Z-Score angezeigt. B Schematischer Zeitplan für die genetischen und pharmakologischen Rettungsexperimente in primären Hippocampuskulturen von Mäusen und induzierten menschlichen Neuronenkulturen. C Signifikante Herunterregulierung der MYT1L-Zielgene Scn5a und Hes1 in MYT1L-defizienten primären Hippocampuskulturen der Maus bei DIV11 nach Myt1l-Überexpression (OE) bei DIV3 im Vergleich zu GFP OE, bestimmt durch qRT-PCR. Diagramme zeigen Säulenstreudiagramme mit angezeigtem Median; n ≥ 8. D Netzwerkhyperaktivität in primären Mausneuronen, denen MYT1L fehlt, kann bei DIV11 durch Überexpression von Myt1l in postmitotischen Neuronen bei DIV3 behoben werden. E Der Abbau von Scn5a durch shRNA-Expression in postmitotischen Neuronen bei DIV3 verringerte die Spike-Häufigkeit von Myt1l (+/−)- und (−/−)-Neuronen. F Hyperaktivität in primären Mausneuronen, denen MYT1L fehlt, kann auch durch akute Anwendung von 10 μM Lamotrigin bei DIV11 behoben werden. Der Abbau von G-SCN5A mit shRNA in vom Menschen induzierten Neuronen führte zu einer verringerten Spike-Häufigkeit. H Erhöhtes Spike-Firing bei MYT1L-Mutation wurde durch akute Anwendung von 10 μM Lamotrigin in induzierten menschlichen Neuronen in Woche 6 auf die Kontrolle normalisiert P23 und die akute Anwendung von 20 mg/kg Lamotrigin können diese Hyperaktivitätsphänotypen normalisieren. Vehikel: n = 23 für (+/+) und n = 29 für (+/−), Lamotrigin: n = 19 für (+/+) und n = 23 für (+/−) Daten aus drei unabhängigen Kohorten. J Schematische Zusammenfassung der Schlüsselrollen von MYT1L in frühen und postnatalen Entwicklungsstadien und Defekten beim MYT1L-Verlust, die teilweise durch genetische und pharmakologische Eingriffe in beiden Stadien kompensiert werden können. Balkendiagramme zeigen Mittelwerte mit der Anzahl der MEA-Vertiefungen aus angegebenen biologischen Replikaten oder Datenpunkten von einzelnen Tieren an, Fehlerbalken = SEM, Mann-Whitney-Test in Panel C, Zwei-Wege-ANOVA in Panel D–I, *p < 0,05, * *p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, NS nicht signifikant.

Im Gegensatz zu den meisten mit neuropsychiatrischen Erkrankungen assoziierten Chromatinregulatoren wird der Transkriptionsfaktor MYT1L in nahezu allen Neuronen spezifisch exprimiert und bleibt ein Leben lang exprimiert [11, 12]. Ob und wie MYT1L-Mutationen neuropsychiatrische Erkrankungen verursachen können, ist jedoch noch weitgehend ungeklärt. In dieser Studie legen wir Beweise dafür vor, dass die MYT1L-Haploinsuffizienz ausreicht, um Phänotypen im Zusammenhang mit NDDs und ASD in menschlichen Neuronen sowie in Mausmodellen zu verursachen, da Zielgene nicht unterdrückt werden können, was zu (i) Verzögerungen während der Entwicklungsneurogenese und (ii) synaptischen Verzögerungen führt Fehlfunktion in reifen Neuronen. Ein MYT1L-Mangel in unseren Menschen- und Mausmodellen führte zu einer erheblichen Deregulierung von Genen, die mit Epilepsie, Schizophrenie und ASD assoziiert sind und bei Patienten mit MYT1L-Mutationen diagnostiziert wurden [13,14,15,16]. Wir fanden auch heraus, dass Genexpressionsveränderungen in Gehirnen von Myt1l-mutierten Mäusen direkt denen ähnelten, die in Gehirnen von ASD-Patienten beobachtet wurden, was zeigt, dass ein MYT1L-Mangel zu ASD-assoziierten Transkriptionsprofilen führen kann. Zu den weiteren Phänotypen im Zusammenhang mit ASD und MYT1L-assoziierten NDDs gehören neurologische Entwicklungsverzögerungen und Veränderungen der Gehirnanatomie. Mittels transkriptomischer Analyse beobachteten wir in vitro eine veränderte Reifungsdynamik in MYT1L-defizienten menschlichen Neuronen nach Transkriptionsfaktor-vermittelter neuronaler Differenzierung und in vivo eine beeinträchtigte Neurogenese im präfrontalen Kortex von Myt1l-mutierten Mäusen. Selbst bei E18.5 zeigten Myt1l-mutierte Mäuse eine Aktivierung frühfötaler Genexpressionsprogramme und eine Herunterregulierung mittelfötaler Programme, was auch in anderen ASD-Modellen beschrieben wurde [5]. Frühere Studien zeigten, dass eine akute Erschöpfung von Myt1l oder des eng verwandten Familienmitglieds Myt1 durch shRNA-Behandlung die Neurogenese in utero durch Unterdrückung der Hes1-Expression und des Notch-Signals beeinträchtigte [21, 69]. Hier erweitern wir diese Ergebnisse, indem wir zeigen, dass die Keimbahn-Myt1l-Mutation den Zellzyklusaustritt kortikaler Vorläufer während der Entwicklung beeinträchtigt und die Anzahl der neuralen SOX2+-Stammzellen in der SVZ bei der Geburt erhöht, was den Phänotypen der Hes1-Überexpression ähnelt (46). Tatsächlich könnte die kombinierte chemische Hemmung von WNT und NOTCH die frühe Induktion proneuronaler Gene in menschlichen induzierten Neuronen wiederherstellen. Dies bestätigt eine beeinträchtigte Neurogenese bei MYT1L-Mangel und könnte den bei Myt1l-mutierten Mäusen beobachteten verdünnten Kortex und die Verzögerungen bei der neurologischen Entwicklung in Menschen- und Mausmodellen erklären.

Eine Einschränkung unserer Studie besteht darin, dass wir nur Frameshift-Mutationen modelliert haben, von denen vorhergesagt wurde, dass sie zu vorzeitigen STOP-Codons von MYT1L beim Menschen und bei der Maus führen, ähnlich wie bei einem gemeldeten Patienten mit einer Nonsense-Mutation bei AA 75 [15]. Unser Mausmodell zeigte einen Frameshift in Exon 6 [70], der nicht funktionierende MYT1L-Protein-Isoformen erzeugte, denen wesentliche Domänen wie das Kernlokalisierungssignal fehlten, während die bedingte Deletion von Exon 7 in unserem menschlichen Modell zu einem durch Unsinn vermittelten RNA-Zerfall führte. Bemerkenswert ist, dass beide Modelle ähnliche Phänotypen der Genregulation und Elektrophysiologie aufwiesen, was darauf hindeutet, dass ein Funktionsverlust unabhängig vom Mutationstyp zu überlappenden Defekten führt. Bemerkenswerterweise beschreiben zwei aktuelle Studien zusätzliche Myt1l-Mausmodelle; Chen et al. erzeugte eine Frameshift-Mutation in Exon 15 [26], und Kim et al. verwendeten eine Exon-9-Exzisionsmutante [27]. Allen drei Modellen ist gemeinsam, dass homozygoter Myt1l-Knockout zu postnataler Letalität und veränderter Gehirnmorphologie führt, was die entscheidende Rolle von MYT1L für die Entwicklung unterstreicht. Darüber hinaus fanden alle drei Studien Verhaltensphänotypen einschließlich Hyperaktivität. Im Einklang mit unserer Studie haben Kim et al. berichteten über eine verminderte Angst. Chen et al. berichteten über männlich-spezifisches beeinträchtigtes Sozialverhalten, das wir auch in unserem Modell fanden, obwohl wir unterschiedliche Tests und Entwicklungsstadien verwendeten. Dennoch weisen die drei Myt1l-mutierten Mausmodelle unterschiedliche Genexpressions- und neurologische Entwicklungsdefekte auf. Im Gegensatz zu unserer Studie haben Chen et al. berichten über einen erhöhten Q-Anteil und eine Abnahme der neuralen SOX2+-Stammzellen bei Myt1l-defizienten Mäusen bei E14.5 und legen nahe, dass MYT1L hauptsächlich als Transkriptionsaktivator fungiert. In einem aktuellen Vorabdruck stellten dieselben Autoren jedoch fest, dass MYT1L Promotoren und Enhancer von Genen, die an frühen neuronalen Entwicklungsprogrammen beteiligt sind, bindet und unterdrückt [71]. Mithilfe der Einzelzelltranskriptomik zeigen wir hier, dass MYT1L-gebundene Gene bei Verlust von MYT1L tatsächlich in kortikalen Neuronen aktiviert werden, was seine Rolle als Repressor unterstützt. In Übereinstimmung damit haben sowohl Chen et al. und unsere Studie fand eine erhöhte Expression früher neurologischer Entwicklungsgensignaturen später in der Entwicklung. Bemerkenswerterweise berichten alle Studien über eine signifikante Überlappung deregulierter Gene mit ASD-Gensätzen. Während die Unterschiede zwischen diesen drei Myt1l-Mausmodellen möglicherweise die unterschiedliche Natur der Mutationen, den genetischen Maushintergrund und die experimentellen Bedingungen widerspiegeln, unterstreicht ihre Überschneidung die wichtige Rolle von MYTL für die neurologische Entwicklung. Zusätzlich zu Funktionsverlustvarianten wurden bei Personen mit neuropsychiatrischen Erkrankungen mehrere De-novo-Missense-Varianten, Indels sowie genomische Duplikationen und Deletionen, die MYT1L umfassen, berichtet (19, 65). Da MYT1L-Patienten verschiedene Phänotypen aufweisen, darunter sowohl Makro- als auch Mikrozephalie, und bei denen verschiedene neuropsychiatrische Störungen wie ASD und Schizophrenie diagnostiziert werden, sind zukünftige Studien erforderlich, um zu klären, wie sich spezifische Mutationen oder genetische Hintergründe auf diese Phänotypen auswirken, indem zusätzliche Maus- und menschliche Stammzellen erzeugt werden Modelle oder durch die Generierung patienteneigener Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen.

Neben der Destabilisierung der neuronalen Zellidentität, die sich in Veränderungen der Genexpression und Verzögerungen bei der Neurogenese äußerte, beobachteten wir auffällige elektrophysiologische Phänotypen in MYT1L-defizienten Neuronen. Unerwarteterweise zeigten primäre Maus- und induzierte menschliche Neuronen einen drei- bis vierfachen Anstieg der neuronalen Netzwerkaktivität, der durch einen Anstieg der sEPSC-Amplitude und der mEPSC-Frequenz untermauert wurde. Da die Häufigkeit von sIPSCs in MYT1L-defizienten Pyramidenneuronen erhöht war, ist eine erhöhte Netzwerkaktivität in unserem Modell wahrscheinlich nicht durch eine verminderte Hemmung verursacht. Bei neugeborenen Myt1l-Mäusen (-/-) beobachteten wir jedoch einen leichten Anstieg des Anteils kortikaler Schicht-I-Neuronen zusammen mit verringerten Cdca7+-Interneuronpopulationen basierend auf der Einzelzellanalyse. Daher bleibt die Wirkung von MYT1L-Mutationen auf inhibitorische Neuronen unklar und erfordert zukünftige Studien. Netzwerkphänotypen könnten durch mehrere Faktoren erklärt werden, wie etwa Veränderungen der neuronalen Morphologie oder Synapsendichte sowie allgemeine Mechanismen, die die Freisetzung von Neurotransmittern regulieren, einschließlich der Deregulierung spannungsgesteuerter Natrium- und Kalziumkanäle [72,73,74]. Interessanterweise könnte die Hochregulierung von Kanälen, die normalerweise nicht spezifisch in Neuronen exprimiert werden, wie z. B. SCN5A, auch die normale synaptische Übertragung in MYT1L-mutierten Neuronen beeinträchtigen. Wir haben daher getestet, ob eine MYT1L-Überexpression, ein shRNA-vermittelter SCN5A-Knockdown oder eine Lamotrigin-Behandlung, von der berichtet wird, dass sie Natrium- und Kalziumkanäle blockiert (67, 68), die durch die MYT1L-Mutation verursachte Netzwerkhyperaktivität retten könnten. Bemerkenswerterweise verringerte die Überexpression von MYT1L die Expression von Zielgenen wie Scn5a und Hes1 in postmitotischen MYT1L-defizienten Mausneuronen, und die Überexpression von MYT1L und der Abbau von SCN5A retteten beide Phänotypen der elektrophysiologischen Netzwerkhyperaktivität. Darüber hinaus normalisierte die akute Anwendung von Lamotrigin nicht nur die Netzwerk-Hyperaktivitätsphänotypen von postmitotischen MYT1L-defizienten Neuronen von Menschen und Mäusen, sondern auch mehrere bei Mäusen beobachtete Verhaltenshyperaktivitätsphänotypen. Dies legt nahe, dass spezifische MYT1L-Haploinsuffizienz-assoziierte Phänotypen durch genetische Eingriffe oder niedermolekulare Medikamente auch später in der Entwicklung gerettet werden können.

Insgesamt präsentieren wir den ersten Beweis dafür, dass MYT1L-Mutationen das Schicksal und die Funktion neuronaler Zellen destabilisieren und ausreichen, um ASD-assoziierte Phänotypen in Menschen- und Mausmodellen zu verursachen. Daher stellt das Versäumnis, die nicht-neuronale Genexpression in Neuronen zum Schweigen zu bringen, einen neuartigen Mechanismus dar, der zumindest teilweise zur ASD-Ätiologie beitragen könnte. MYT1L ist ein einzigartiger Transkriptionsfaktor, der mit neurologischen Entwicklungskrankheiten in Zusammenhang steht und im Laufe des Lebens in praktisch allen Neuronen spezifisch exprimiert wird. Es ist daher verlockend zu spekulieren, dass die aktive lebenslange Unterdrückung nicht-neuronaler Programme ein evolutionär konservierter Signalweg ist, der für die Prävention von Hirnstörungen von entscheidender Bedeutung ist. Interessanterweise sinken die MYT1L-Spiegel im Laufe des Alterns sowohl bei Mäusen als auch beim Menschen (ergänzende Abbildung S1A), und kürzlich wurde vermutet, dass der Verlust der neuronalen Zellidentität in Alzheimer-Krankheitsmodellen eine Rolle spielt [75, 76], was darauf hindeutet, dass auch Neurodegeneration eine Rolle spielen könnte reguliert durch den hier vorgestellten neuartigen MYT1L-vermittelten Mechanismus. Schließlich zeigen wir, dass unerwartete elektrophysiologische Netzwerkhyperaktivität bei MYT1L-Mangel in postmitotischen Maus- und menschlichen Neuronen und damit verbundene Verhaltensphänotypen bei Mäusen durch das zugelassene Medikament Lamotrigin gezielt angegangen werden können, was eine Möglichkeit für therapeutische Interventionen bieten könnte.

Alle Daten sind im Haupttext oder den ergänzenden Materialien verfügbar. GSEA wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Sequenzierungsdaten der nächsten Generation sind auf NCBI GEO GSE171327 verfügbar. Massenspektrometriedaten können auf PRIDE PXD037867 abgerufen werden.

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Referenzen herunterladen

Wir danken L. Meng und M. Wernig für ihre Unterstützung bei der Erzeugung und großzügigen Weitergabe von Mäusen mit MYT1L-Mangel. Wir danken I. Everlien für die technische Beratung und K. Oliveras Mate für die erste Transkriptanalyse. Wir danken den Kerneinrichtungen des DKFZ, insbesondere der Genomics and Proteomics Core Facility (A. Schulz), dem scOpenLab (P. Mallm), den Betreuern am Center for Preclinical Research (S. So) und der Lichtmikroskopie-Einrichtung (M. Brom, D. Krunic). Wir danken außerdem B. Kurpiers und C. Pitzer vom Interdisciplinary Neurobehavioural Core der Universität Heidelberg für die hervorragende Unterstützung. Wir danken C. Schaaf, D. Odom, F. Winkler, L. Steinmetz, H. Ahlenius, A. Agarwal und den Mitgliedern des Mall-Labors, darunter T. Kanamaru, für Ideen und Diskussionen.

Diese Arbeit wurde durch Mittel der Chica und Heinz Schaller Stiftung, NARSAD Young Investigator Grant 2019, DFG SFB1158-SO2, und eines Fritz Thyssen Grant to CAc and CellNetworks (EXC81) 2021, NARSAD Young Investigator Grant 2020, DFG 504019642, ERC StG, unterstützt Nr. 804710 und der Hector Stiftung II gGmbH an MM. DP wurde vom DFG SFB1324 gefördert. Stipendien wurden vom DAAD/ANID an JC (57451854/62180003) und von der Helmholtz International Graduate School an BW, JFT, BL, JT und MS vergeben. Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Ignacio L. Ibarra

Aktuelle Adresse: Institut für Computational Biology, Helmholtz Zentrum München, Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt, 85764, Neuherberg, Deutschland

Diese Autorinnen haben gleichermaßen beigetragen: Bettina Weigel, Jana F. Tegethoff.

Cell Fate Engineering and Disease Modeling Group, Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ) und DKFZ-ZMBH-Allianz, 69120, Heidelberg, Deutschland

Bettina Weigel, Jana F. Tegethoff, Sarah D. Grieder, Bryce Lim, Bhuvaneswari Nagarajan, Jule Truberg, Juan M. Adrian-Segarra, Laura K. Schmidt, Janina Kaspar, Eric Poisel, Elisa Heinzelmann, Manu Saraswat, Marleen Christ & Moritz Einkaufszentrum

HITBR Hector Institut für Translationale Hirnforschung gGmbH, 69120, Heidelberg, Deutschland

Bettina Weigel, Jana F. Tegethoff, Sarah D. Grieder, Bryce Lim, Bhuvaneswari Nagarajan, Jule Truberg, Juan M. Adrian-Segarra, Laura K. Schmidt, Janina Kaspar, Eric Poisel, Elisa Heinzelmann, Manu Saraswat, Marleen Christ & Moritz Einkaufszentrum

Zentralinstitut für Seelische Gesundheit, Medizinische Fakultät Mannheim, Universität Heidelberg, 68159, Mannheim, Deutschland

Bettina Weigel, Jana F. Tegethoff, Sarah D. Grieder, Bryce Lim, Bhuvaneswari Nagarajan, Jule Truberg, Juan M. Adrian-Segarra, Laura K. Schmidt, Janina Kaspar, Eric Poisel, Elisa Heinzelmann, Manu Saraswat, Marleen Christ & Moritz Einkaufszentrum

Fakultät für Biowissenschaften, Universität Heidelberg, 69120, Heidelberg, Deutschland

Bettina Weigel, Jana F. Tegethoff, Bryce Lim, Jule Truberg & Manu Saraswat

Abteilung für Klinische Neurobiologie, Universitätsklinikum Heidelberg und DKFZ, Heidelberg, Deutschland

Yu-Chao Liu & Hannah Monyer

Abteilung für Proteomik von Stammzellen und Krebs, Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), 69120, Heidelberg, Deutschland

Dimitris Papageorgiou und Jeroen Krijgsveld

Medizinische Fakultät, Universität Heidelberg, 69120, Heidelberg, Deutschland

Dimitris Papageorgiou und Jeroen Krijgsveld

Europäisches Labor für Molekularbiologie, Abteilung für Struktur- und Computerbiologie, 69115, Heidelberg, Deutschland

Christian Arnold, Ignatius L. Ibarra und Judith B. Zaugg

Forschungsgruppe Chica und Heinz Schaller, Institut für Anatomie und Zellbiologie, Universität Heidelberg, 69120, Heidelberg, Deutschland

Joaquin Campos & Claudio Acuna

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BW und JFT waren für Forschungsdesign, Durchführung, Analyse und Manuskripterstellung verantwortlich. BL, EP, MS, ILI und CAr haben die bioinformatische Analyse entworfen und implementiert. SG führte das Stammzell-Engineering durch und führte Experimente mit induzierten Neuronen durch. JT, LKS, MC und JK trugen zur primären Kultur- und Bildanalyse bei. BN und JK unterstützten Verhaltensstudien. JAS führte Einzelzellexperimente durch. YCL, JC und CAc führten die Elektrophysiologie durch. DP und JK führten die Massenspektrometrie durch. HM, CAc und JZ berieten beim Forschungsdesign und der Manuskripterstellung. MM entwarf und überwachte die Forschung, interpretierte die Daten und verfasste das Manuskript unter Einbeziehung aller Autoren.

Korrespondenz mit Moritz Mall.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Weigel, B., Tegethoff, JF, Grieder, SD et al. MYT1L-Haploinsuffizienz in menschlichen Neuronen und Mäusen verursacht Autismus-assoziierte Phänotypen, die durch genetische und pharmakologische Eingriffe umgekehrt werden können. Mol Psychiatrie (2023). https://doi.org/10.1038/s41380-023-01959-7

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Eingegangen: 24. März 2022

Überarbeitet: 30. Dezember 2022

Angenommen: 11. Januar 2023

Veröffentlicht: 14. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-023-01959-7

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