Verbesserungsstrategie für eine effektive Gefäßregeneration nach einem Myokardinfarkt durch einen dualen Stammzellansatz

Experimental & Molecular Medicine Band 54, Seiten 1165–1178 (2022)Diesen Artikel zitieren

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Da eine beeinträchtigte koronare Blutversorgung nach einem Myokardinfarkt (MI) die Herzfunktion negativ beeinflusst, gilt die therapeutische Neovaskularisation als eine der wichtigsten Therapiestrategien für die zellbasierte Herzreparatur. Um eine therapeutische Neovaskularisierung in ischämischen Herzen effektiver zu erreichen, haben wir einen dualen Stammzellansatz für eine effektive Gefäßregeneration entwickelt, indem wir zwei verschiedene Arten von Stammzellen verwenden, CD31+-Endothelzellen, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC-ECs) stammen und manipuliert wurden menschliche mesenchymale Stammzellen, die kontinuierlich den stromal abgeleiteten Faktor 1α (SDF-eMSCs) sezernieren, um gleichzeitig die natale Vaskulogenese und Angiogenese, zwei Kernmechanismen der Neovaskularisation, zu fördern. Um eine umfassendere Gefäßregeneration zu induzieren, haben wir hiPSC-ECs intramyokardial injiziert, um De-novo-Gefäße zu erzeugen, möglicherweise über Vaskulogenese, und ein 3D-Herzpflaster, das SDF-eMSCs (SDF-eMSC-PA) einkapselt, um die Angiogenese durch längere Sekretion parakriner Faktoren zu verbessern, einschließlich SDF-1α wurde in das Epikard ischämischer Herzen implantiert. Wir haben bestätigt, dass hiPSC-ECs direkt zur De-novo-Gefäßbildung in ischämischen Herzen beitragen, was zu einer verbesserten Herzfunktion führt. Darüber hinaus verbesserte die gleichzeitige Implantation von SDF1α-eMSC-PAs das Überleben, die Retention und das vaskulogene Potenzial von hiPSC-ECs erheblich und führte letztendlich zu einer umfassenderen Neovaskularisierung in den MI-Herzen. Bemerkenswert ist, dass die durch den dualen Stammzellansatz neu gebildeten Gefäße deutlich größer und funktioneller waren als diejenigen, die allein durch hiPSC-ECs gebildet wurden. Zusammenfassend liefern diese Ergebnisse überzeugende Beweise dafür, dass unsere Strategie zur wirksamen Gefäßregeneration ein wirksames Mittel zur Behandlung ischämischer Herzerkrankungen sein kann.

Ischämische Herzerkrankungen (IHDs) sind weltweit eine der häufigsten Ursachen für Morbidität und Motilität1. Insbesondere der Myokardinfarkt (MI), eine repräsentative Form der koronaren Herzkrankheit, schädigt sowohl die Herzmuskulatur als auch die Blutgefäße übermäßig2. Da die Schädigung der Herzkranzgefäße eine der kritischsten pathophysiologischen Ursachen bei Myokardinfarkt ist, konzentrierten sich die bisherigen Ansätze auf die Wiederherstellung eines funktionell perfundierbaren Gefäßsystems im ischämischen Herzen durch therapeutische Neovaskularisation3. Trotz ermutigender Ergebnisse präklinischer Studien führten die Ergebnisse nachfolgender klinischer Studien nicht zu konsistenten, schlüssigen Ergebnissen. Eine wahrscheinliche Erklärung für diese Diskrepanz zwischen präklinischen und klinischen Ergebnissen ist das Versäumnis, für eine längere angiogene Stimulation über einen bestimmten Zeitraum hinweg optimale Werte an angiogenetischen Faktoren im Zielgebiet aufrechtzuerhalten, was technisch anspruchsvoll ist und als unerschwinglich angesehen wird4.

Es ist allgemein anerkannt, dass das perfundierbare Gefäßsystem im ischämischen Herzen durch therapeutische Neovaskularisation wiederhergestellt werden kann5. In mehreren früheren Studien wurde dargelegt, dass die therapeutische Neovaskularisation im Allgemeinen zwei unterschiedliche Prozesse umfasst: Angiogenese und Vaskulogenese. Angiogenese ist definiert als das Wachstum bereits bestehender Blutgefäße, und Vaskulogenese bezieht sich auf die De-novo-Erzeugung von Gefäßen aus Endothelzellen (ECs), endothelialen Vorläuferzellen (EPCs) oder anderen Arten von Stammzellen6. Da mehrere frühere Studien ausführlich darüber berichtet haben, dass die Induktion der Angiogenese für die Gefäßregeneration wirksam ist, wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um eine effiziente Strategie zur Förderung der myokardialen Angiogenese zur Behandlung ischämischer Herzerkrankungen zu entwickeln. Beispielsweise wird in einer Reihe präklinischer Einrichtungen die Verabreichung von proangiogenen Faktoren wie dem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) und dem Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) in Form von rekombinanten Proteinen, nackten DNA-Plasmiden oder … durchgeführt Es wurde gezeigt, dass modifizierte VEGF-RNA die Blutgefäßbildung, die Myokardfunktion und die Langzeitüberlebensrate erheblich verbessert, was darauf hindeutet, dass die Förderung der Angiogenese eine wirksame Therapiestrategie zur Behandlung von Herzversagen ist.

Während bekannt ist, dass die Angiogenese sowohl im Embryonal- als auch im Erwachsenenleben auftritt, geht man davon aus, dass die Vaskulogenese nur während der Embryonalentwicklung auftritt7. Jüngste Erkenntnisse deuten jedoch darauf hin, dass die Vaskulogenese nicht auf die frühe Embryogenese beschränkt ist, sondern auch zur Pathophysiologie von Gefäßerkrankungen im postnatalen Leben beitragen kann8. Dieses Konzept entstand aus der Beobachtung, dass sowohl ECs als auch EPCs im Kreislauf nebeneinander existieren und dass sich während des Tumorwachstums neue Blutgefäße entwickeln. Diese Identifizierung zirkulierender EPCs in erwachsenen Wirbeltieren deutete erneut auf eine funktionelle Rolle mehrerer aus dem Knochenmark stammender Zelltypen bei der postnatalen Vaskulogenese hin9. Anschließend wurde in mehreren Studien berichtet, dass die Transplantation von EPCs, mononukleären Zellen (MNCs) und mesenchymalen Stammzellen (MSCs) eine therapeutische Neovaskularisation in erwachsenen ischämischen Geweben induzierte10,11,12. Ihr Potenzial, sich in ECs zu differenzieren und eine sukzessive Vaskulogenese zu durchlaufen, ist jedoch suboptimal, da ihre Hauptmechanismen eher parakrine Effekte als eine De-novo-Vaskulogenese beinhalten. In jüngerer Zeit wurden ECs, die aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC-ECs), einschließlich humaner embryonaler Stammzellen (hESCs) und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs), stammen, als neue Zellquelle für die Vaskulogenese vorgeschlagen. Obwohl hPSC-ECs ein relativ höheres vaskulogenes Potenzial als andere Zellen aufwiesen, ist ihre Fähigkeit, die Vaskulogenese zu induzieren, immer noch unzureichend und ineffizient13,14,15. Beispielsweise zeigte eine kürzlich durchgeführte Studie, bei der hPSC-ECs in einem Hinterbein-Ischämiemodell eingesetzt wurden, dass es mehrere Monate dauerte, bis sich in ischämischem Gewebe funktionsfähige Blutgefäße bildeten, was auf das begrenzte Potenzial von hPSC-ECs bei der Vaskulogenese hindeutet. Damit hPSC-ECs effektiver zur therapeutischen Neovaskularisation in ischämischen Geweben eingesetzt werden können, muss daher eine innovative Methode zur Förderung des vaskulogenen Potenzials entwickelt werden.

Daher haben wir in der aktuellen Studie eine Strategie entwickelt, um das Gefäßsystem in ischämischen Herzen effektiv zu rekonstruieren, indem wir zwei verschiedene Arten von Zellquellen nutzen, CD31+ hiPSC-ECs und gentechnisch veränderte MSCs aus menschlichem Knochenmark, die kontinuierlich den aus dem Stroma stammenden Faktor 1α absondern (SDF-eMSCs) innerhalb eines dreidimensionalen (3D) Herzpflasters, das in das Epikard von MI-induzierten Herzen implantiert wird. Wir gehen davon aus, dass intramyokardial injizierte hiPSC-ECs über Vaskulogenese De-novo-Gefäße erzeugen würden, wohingegen epikardial implantierte SDF-eMSC-Pflaster (SDF-eMSC-PAs) gleichzeitig die Angiogenese von Wirtsgefäßen verbessern würden, was mit der Sekretion von angiogenen parakrinen Faktoren, insbesondere SDF, vereinbar wäre. in MI-induzierten Herzen. Da die Grundlage der nativen Neovaskularisation nicht auf die Angiogenese beschränkt ist, sondern auch die postnatale Vaskulogenese umfasst, kamen wir zu dem Schluss, dass sich Strategien zur therapeutischen Neovaskularisation darauf konzentrieren sollten, alle diese Prozesse umfassend zusammen zu induzieren, um eine echte Gefäßregeneration in ischämischen Herzen zu erreichen. Um SDF-eMSC-PAs als Zellreservoir zur Sekretion mehrerer nützlicher Zytokine, einschließlich SDF-1α, zu verwenden, verwendeten wir ein aus dem Herzen stammendes extrazelluläres Matrix-Hydrogel (hdECM), um die kardiale gewebespezifische Mikroumgebung so genau wie möglich nachzubilden. Anschließend haben wir gezeigt, dass unser dualer zellulärer Ansatz mit hiPSC-ECs und SDF-eMSC-PAs zu einer signifikanten Verbesserung der Gefäßbildung und einer verbesserten Herzfunktion führte. Diese Ergebnisse deuten auf erhebliche therapeutische Implikationen für die Gefäßregeneration in ischämischen Herzen hin.

Das hdECM wurde wie zuvor beschrieben16,17 vorbereitet. Kurz gesagt, Herzgewebe eines 6 Monate alten koreanischen Hausschweins wurde mit Genehmigung des Lieferanten auf einem Viehmarkt gekauft. Wir haben die linke Herzkammer aus dem kompletten Schweineherz herausgeschnitten und in kleine Stücke geschnitten. Die kleinen Stücke Herzgewebe wurden 48 Stunden lang in 1%iger Natriumdodecylsulfatlösung (Affymetrix, CA) eingeweicht, gefolgt von einer einstündigen Behandlung mit 1% Triton X-100-Lösung in PBS (Biosesang, Korea). Anschließend wurden die dezellularisierten Gewebe drei Tage lang in PBS getaucht, um das restliche Detergens zu entfernen. Anschließend wurden die dezellularisierten Herzgewebe lyophilisiert, in flüssigem Stickstoff pulverisiert und in 10 ml 0,5 M Essigsäurelösung (Merck Millipore, Billerica, MA) bei einer Endkonzentration von 3,3 Gew./Vol.-% (330 mg hdECM-Pulver) verdaut 33 mg Pepsinpulver. Die verdaute hdECM-Lösung wurde durch ein 40-µm-Porennetz filtriert, in 1 ml aliquotiert und für weitere Experimente bei -20 °C gelagert. Vor der Herstellung der Herzpflaster wurde die hdECM-Lösung durch Zugabe von 10 N NaOH-Lösung auf einen neutralen pH-Wert von 7,4 eingestellt, während das konische Röhrchen in einem Eiskübel aufbewahrt wurde, um eine Gelierung von hdECM zu vermeiden.

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Katholischen Universität Korea genehmigt (Genehmigungsnummer: CUMC-2020-0051-01). Das IACUC und die Abteilung für Labortiere (DOLA) der Katholischen Universität von Korea, Campus Songeui, haben die Korea Excellence Animal Laboratory Facility 2017 von der koreanischen Lebensmittel- und Arzneimittelbehörde akkreditiert und 2018 die vollständige Akkreditierung von AAALAC International erhalten. Alle Tierversuche entsprachen den Richtlinien von Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere oder die NIH-Richtlinien. Fischer 344-Ratten (160–180 g, männlich, Koatec, Korea) wurden mit 2 % inhaliertem Isofluran anästhesiert und über die Luftröhre mit einem 18-Gauge-Intravenöskatheter intubiert. Anschließend wurden die Ratten mechanisch mit einem Nagetier-Beatmungsgerät (55-7058, Harvard Apparatus, Kanada) beatmet. Die Tiere wurden auf ein 37 °C warmes Heizkissen gelegt, um ein Auskühlen während des Verfahrens zu verhindern. Nach der Rasur der Brust und der Sterilisation mit 70 %igem Alkohol führten wir eine linke Thorakotomie durch. Der Myokardinfarkt wurde durch Knüpfen einer Naht mit einem sterilen Polyethylenglykolschlauch (22 G) induziert, der 1 Minute lang in die linke anteriore absteigende Arterie (LAD) gelegt wurde, und der Knoten wurde mit einer 7-0-Prolennaht dauerhaft abgebunden. Um die Ausgangsfunktion des linken Ventrikels zu ermitteln, untersuchten wir die Ejektionsfraktion (EF) nach Operationstag (POD) 7 (Einschlusskriterium: EF < 45 % basierend auf echokardiographischer Auswertung). Am nächsten Tag wurden die Ratten erneut mittels Isofluran-Inhalation betäubt, intubiert und mechanisch beatmet. Der Brustkorb des Tieres wurde erneut geöffnet und das Perikard teilweise aus dem infarktierten Herzen entfernt. Fünf experimentelle Gruppen wie folgt: (1) Scheinkontrolle, (2) MI-Kontrolle, (3) SDF-eMSC-PA implantiertes Epikard von MI-Herzen (nur PA, 1 × 106), (4) hiPSC-ECs, intramyokardiale Injektion ( Nur EC, 1 × 106) und (5) kombinierte Plattform aus hiPSC-ECs und SDF-eMSC-PA (EC + PA, jeweils 1 × 106). Die hiPSC-ECs wurden an zwei verschiedenen Stellen in der Grenzzone des infarktierten Herzens injiziert und die 3D-Herzpflaster (Durchmesser: 1 cm) wurden mit drei Nähten direkt auf das Epikard implantiert. Der Brustkorb wurde aseptisch verschlossen und es wurden Antibiotika und 0,9 %ige Kochsalzlösung verabreicht. Alle Ratten erhielten die folgenden Immunsuppressiva wie zuvor beschrieben:18,19 Azathioprin, 2 mg/kg; Cyclosporin A, 5 mg/kg; und Methylprednisolon, 5 mg/kg täglich.

Die Tiere wurden leicht mit Isofluran betäubt und mit einem Heizkissen bei 37 °C gehalten. Die Beurteilung der funktionellen Verbesserung des verletzten Herzgewebes wurde mit der Echokardiographie durchgeführt, wie wir zuvor beschrieben haben20,21. Die Ratten wurden mit inhaliertem Isofluran leicht anästhesiert und physiologische Daten wurden mit einem transthorakalen Echokardiographiesystem aufgezeichnet, das mit einem 15-MHz-L15-7io-Linearwandler (Affniti 50 G, Philips) ausgestattet war. Serielle Echokardiogramme wurden vor, 2, 4 und 8 Wochen nach der Zellbehandlung durchgeführt. Der Echokardiograph war während des Experiments hinsichtlich der Gruppenzuordnung blind.

Hämodynamische Messungen wurden 8 Wochen vor der Euthanasie durchgeführt. Nach einer Thorakotomie ohne Blutung wurde die LV-Herzspitze mit einer 26-Gauge-Nadel punktiert und ein 2-F-Leitfähigkeitskatheter (SPR-838, Millar) in den LV eingeführt. LV-Druck-Volumen-Parameter (PV) wurden kontinuierlich mit einem PV-Leitfähigkeitssystem (MPVS Ultra, EMKA Technologies, Paris, Frankreich) aufgezeichnet, das an einen digitalen Wandler (PowerLab 16/35, ADInstruments, Colorado Springs, CO) gekoppelt war. Belastungsunabhängige Messungen der Herzfunktion, einschließlich der Steigungen der postsystolischen Druck-Volumen-Beziehung (ESPVR) und der enddiastolischen Druck-Volumen-Beziehung (EDPVR), wurden mit unterschiedlichen Vorlasten erhalten, die über eine vorübergehende untere Hohlvene (IVC) hervorgerufen wurden. Okklusion mit einem Nadelhalter. Ein Aliquot von 50 µl hypertoner Kochsalzlösung (20 % NaCl) wurde in die linke Halsvene injiziert, um die Parallelleitfähigkeit nach hämodynamischen Messungen zu berechnen. Das Blut wurde aus dem linken Ventrikel in einer heparinisierten Spritze gesammelt und in Küvetten gegeben, um das Leitfähigkeitssignal mithilfe des Katheters in Volumen umzuwandeln. Das absolute Volumen der Ratte wurde durch Kalibrierung der Parallelleitfähigkeit und der Küvettenleitfähigkeit definiert.

Zur Bestimmung der Umfangsfibrose und des lebensfähigen Myokards wurde Massons Trichrom-Färbung (Sigma, St. Louis, MO, USA) wie folgt durchgeführt. Kurz gesagt, drei Paraffinobjektträger wurden vor der Entparaffinierung und Rehydratisierung in einem Trockenofen bei 37 ° C vorinkubiert. Anschließend wurden die Paraffinschnitte eine Stunde lang in 56 °C warmer Bouin-Lösung erneut fixiert. Diese Schnitte wurden mit Weigerts Eisen-Hämatoxylin-Lösung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gefärbt und anschließend 20 Minuten lang mit Biebrich-Scharlachsäure-Fuchsin-Lösung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur gefärbt. Abschließend wurden die Schnitte 15 Minuten lang mit Anilinblau gegengefärbt, gefolgt von einer 1-minütigen Inkubation mit 1 % Essigsäure bei Raumtemperatur. Zwischen jedem Schritt wurden umfangreiche Waschvorgänge durchgeführt. Anschließend erfolgte die Bildgebung der Herzabschnitte mit einem Diascanner (Pannoramic MIDI). Das Verhältnis der Fibrose wurde als Fläche der Fibrose zur Fläche des LV-Umfangs [(Infarktfläche/LV-Wandfläche) * 100] berechnet. Darüber hinaus wurde das Verhältnis des lebensfähigen Myokards als die Fläche des lebensfähigen Myokards innerhalb des Infarktbereichs quantifiziert, in dem die LV-Wand erweitert ist und der fibrotische Bereich sichtbar ist. [(lebensfähige Myokardfläche/Infarktfläche) * 100]. Beide Messungen wurden mit der ImageJ-Software durchgeführt.

Alle quantitativen Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt, sofern nicht anders angegeben. Die signifikanten Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden durch zweiseitige Student-t-Tests analysiert. Die signifikanten Unterschiede zwischen den vier Gruppen wurden auch von ANOVA mit der Post-hoc-Analyse von Bonferroni analysiert. Die Ergebnisse wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn der p-Wert weniger als 0,05 betrug.

Mehrere frühere Studien berichteten über die erfolgreiche Erzeugung von ECs aus hiPSCs (hiPSC-ECs) unter Verwendung einer Kombination kleiner Moleküle, einschließlich eines GSK3-Inhibitors22. Basierend auf früheren Berichten haben wir hiPSC-ECs aus hiPSCs unter Verwendung des GSK3-Inhibitors CHIR99021 generiert (Ergänzende Materialien und Methoden, ergänzende Abbildung 1a). Um in weiteren Experimenten hiPSC-ECs zu produzieren, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren, um die Zellverfolgung im Herzgewebe zu erleichtern, haben wir hiPSCs, die GFP-Signale exprimieren, durch Transfektion von lentiviralen GFP-Partikeln hergestellt, sie durch FACS basierend auf der GFP-Expression angereichert und zur Differenzierung verwendet in ECs (ergänzende Abbildung 1b). qRT-PCR-Ergebnisse bestätigten, dass das Expressionsniveau von OCT4, einem Pluripotenzmarker, signifikant verringert und das Expressionsniveau von CD31, einem spezifischen Marker für EC, in den hiPSCs, die sich in die EC-Linie differenzieren, signifikant erhöht war (ergänzende Abbildung 1c, Ergänzungstabelle 1). Am Differenzierungstag 7 beobachteten wir, dass etwa 25,08 % der differenzierenden hiPSC-ECs positiv für humane CD31-Antikörper waren, und haben diese CD31+-Zellen anschließend durch FACS angereichert. Nach FACS wurden die angereicherten CD31 + hiPSC-ECs in humanem endothelserumfreiem Medium mit Zytokinen, einschließlich VEGF, gehalten, um ihre Eigenschaften als Zellen der EC-Linie beizubehalten (ergänzende Abbildung 1c). Die CD31+ hiPSC-ECs zeigten eine typische kopfsteinpflasterartige EC-Morphologie und exprimierten ähnliche mRNA-Spiegel von EC-spezifischen Markern, wie Differenzierungscluster 31 (CD31), vaskuläres endotheliales Cadherin (VE-Cadherin), Von-Willebrand-Faktor (vWF) und vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktorrezeptor 2 (VEGFR2) im Vergleich zu menschlichen Nabelschnurendothelzellen (HUVECs) (ergänzende Abbildung 1c, d). Die Ergebnisse der Durchflusszytometrieanalyse zeigten außerdem, dass die CD31+ hiPSC-ECs zu 97,19 % bzw. 85,53 % positiv für CD31 bzw. CD144 waren (ergänzende Abbildung 1e). Darüber hinaus bestätigten die Immunfluoreszenzergebnisse, dass die CD31+ hiPSC-ECs reichliche Mengen der CD31- und vWF-Proteine exprimierten (ergänzende Abbildung 1f). Auf funktioneller Ebene zeigten die CD31 + hiPSC-ECs die Fähigkeit zur Aufnahme von Ac-LDL (ergänzende Abbildung 1g) und die Bildung eines kapillarähnlichen Netzwerks auf Matrigel (ergänzende Abbildung 1h).

Um festzustellen, ob die CD31+ hiPSC-ECs (später hiPSC-ECs) über einen Vaskulogenese-abhängigen Mechanismus in MI-induzierten Herzen De-novo-Gefäße bilden können, injizierten wir hiPSC-ECs intramyokardial an zwei verschiedenen Stellen in der Grenzzone des MI-induzierten Herzens Rattenherzen. MI wurde durch die Unterbindung der linken anterioren absteigenden Arterie (LAD) im Herzen erzeugt. Zu Verfolgungszwecken wurden hiPSC-ECs verwendet, die kontinuierlich das grüne Fluoreszenzsignal (GFP) exprimieren. Um die funktionellen Gefäße in den MI-induzierten Herzen sichtbar zu machen, führten wir vor der Gewebeentnahme 8 Wochen nach der Injektion mit hiPSC-ECs eine Perfusionsfärbung mit Isolection-B4 (IB4), konjugiert mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff, Rhodamin, im Herzen durch. Fluoreszenzbildanalysen zeigten, dass die Anzahl der IB4+-Kapillaren in den mit hiPSC-EC injizierten Herzen signifikant höher war als in den MI-Kontrollherzen (Abb. 1a).

a Repräsentative Bilder von mit IB4-Rhodamin (rot) gefärbten Blutgefäßen in der Infarktzone, Grenzzone und Fernzone sowie 8 Wochen nach der Injektion von hiPSC-ECs und deren Quantifizierungszusammenfassung. Zur Quantifizierung wurde die Anzahl der Kapillaren in fünf zufällig ausgewählten Feldern (mm2) in jedem Herzen gezählt. n = 5. *p < 0,05. Maßstabsbalken: 100 µm. b Repräsentatives Bild von Blutgefäßen, die durch iPSC-ECs-GFP (grün), IB4-Rhodamin (rot) und DAPI (blau) neu gebildet wurden. Maßstabsbalken: 20 µm. c–j Ratten, die sich einem MI unterzogen, wurden intramyokardial hiPSC-ECs oder Kontrollzellen injiziert, gefolgt von einer echokardiographischen Analyse. c Die schematische Zeitleiste von der MI-Modellierung und Transplantation von iPSC-EC bis zur Messung der Herzfunktion. d Linksventrikuläre Ejektionsfraktion (EF), (e) linksfraktionelle Verkürzung (FS), (f) linksventrikuläre interne diastolische Dimension (LVIDd), (g) linksventrikuläre interne systolische Dimension (LVIDs), (h) Septumwanddicke ( SWT), (i) hintere Wanddicke (PWT) und (j) relative Wanddicke (RWT). n = 6. *p < 0,05. k Repräsentative Bilder, die Herzfibrose nach Färbung mit Massons Trichrom in den Herzen zeigen, die 8 Wochen nach der Zellbehandlung entnommen wurden. Quantifizierungsergebnisse von Herzfibrose (l) und lebensfähigem Myokard (m). n = 5. *p < 0,05. Maßstabsbalken: 2000 µm.

Um das Potenzial und die Größe des Beitrags von hiPSC-ECs zur Vaskulogenese in den MI-Herzen zu bewerten, haben wir als Nächstes die GFP- und RFP-Signale von hiPSC-ECs im Herzgewebe verfolgt. Konfokalmikroskopische Bilder zeigten eine beträchtliche Anzahl von Gefäßen, die sowohl für IB4- als auch für GFP-Signale von hiPSC-ECs doppelt positiv waren, im Infarktbereich des Herzgewebes, das 8 Wochen nach der Injektion hiPSC-ECs erhielt. Interessanterweise wurde eine beträchtliche Anzahl von hiPSC-ECs in das Kapillarnetzwerk des Wirts eingebaut, und viele von ihnen befanden sich im perivaskulären Bereich (Abb. 1b). Die Ergebnisse deuten eindeutig darauf hin, dass hiPSC-ECs De-novo-Gefässe in ischämischen Herzen rekonstruieren könnten.

Angesichts der Tatsache, dass eine durch Vaskulogenese verbesserte Gefäßregeneration zu einer funktionellen Erholung nach MI führt, stellten wir die Hypothese auf, dass die intramyokardiale Injektion von hiPSC-ECs in MI-Herzen die Herzfunktion fördern könnte. Anschließend führten wir eine serielle Echokardiographie durch, um die Funktion des linken Ventrikels (LV) und den Umbau des Herzens nach PRE (1 Woche nach dem MI und vor der Zellbehandlung) sowie 2, 4 und 8 Wochen nach der Zellbehandlung zu bewerten. In dieser Studie verwendeten wir ein MI-Modell, bei dem Zellen eine Woche nach der Induktion des MI transplantiert wurden, um die klinische Situation von MI-Patienten so genau wie möglich nachzubilden. Die Ergebnisse der Echokardiographie zeigten, dass sowohl die Ejektionsfraktion (EF) als auch die fraktionierte Verkürzung (FS) in allen Versuchsgruppen im Vergleich zur Scheingruppe, die keine Intervention erhielt, signifikant niedriger waren. (Ergänzende Abbildung 2a – g). Wichtig ist, dass die Herzen, die hiPSC-ECs erhielten, bis 8 Wochen nach der Zellbehandlung signifikant höhere EF und FS aufwiesen als die Herzen in der MI-Kontrollgruppe (Abb. 1c – d). Unter mehreren Parametern für den Umbau des Herzens, wie z. B. der inneren diastolischen Dimension des linken Ventrikels (LVIDd), der inneren systolischen Dimension des linken Ventrikels (LVISd), der Septumwandstärke (SWT), der hinteren Wandstärke (PWT) und der relativen Wandstärke (RWT), sind die LVIDd und LVIDs waren in den mit hiPSC-EC behandelten Herzen signifikant niedriger als in den MI-Kontrollherzen, was darauf hindeutet, dass hiPSC-ECs die Herzen vor unerwünschten kardialen Umbauten schützten. (Abb. 1e – i und ergänzende Abb. 2h). In ähnlicher Weise zeigten die Ergebnisse der Masson-Trichrom-Färbung, die unter Verwendung von Herzgewebe erhalten wurde, das 8 Wochen nach der Zellbehandlung entnommen wurde, dass der Bereich der Fibrose (%) in der Gruppe, der hiPSC-EC injiziert worden war, erheblich kleiner und das lebensfähige Myokard (%) größer war das in der MI-Kontrollgruppe (Abb. 1j – m). Basierend auf diesen Ergebnissen haben wir bestätigt, dass hiPSC-ECs in vivo in MI-exponierten Herzen direkt zur De-novo-Gefäßbildung beitragen können, was zu einer verbesserten Herzfunktion führt.

Anschließend untersuchten wir unsere zentrale Hypothese, ob die gleichzeitige Induktion von Vaskulogenese und Angiogenese zu einer umfassenden Gefäßregeneration und Funktionsverbesserung in den MI-Herzen führen könnte. Da wir bereits nachgewiesen haben, dass hiPSC-ECs erfolgreich eine Vaskulogenese in den MI-Herzen erreichen konnten, versuchten wir, eine zusätzliche zelluläre Quelle zu identifizieren, die eine komplementäre Angiogenese aus den Blutgefäßen im Wirtsherzen induzieren kann, und beschlossen schließlich, gentechnisch veränderte menschliche mesenchymale Stammzellen zu testen setzen kontinuierlich menschliches SDF-1α-Protein (SDF-eMSCs) frei23. Die SDF-eMSCs waren nicht von normalen BM-MSCs zu unterscheiden. Die SDF-eMSCs zeigten eine homogene spindelförmige Zellmorphologie, die hMSCs darstellte (Ergänzende Materialien und Methoden, ergänzende Abbildung 3a). Die SDF-eMSCs hatten ein hohes Proliferationspotenzial, basierend auf dem allmählichen Anstieg der Populationsverdopplungswerte (PDL) während der Kulturzeiten im Vergleich zu normalen BM-MSCs24 (ergänzende Abbildung 3b). Die SDF-eMSCs exprimierten mehrere für menschliche MSCs spezifische Marker wie CD90, CD44, CD105 und CD73, ohne die Expression von CD34, CD11b, CD19, CD45 und HLA-DR (ergänzende Abbildung 3c). Die SDF-eMSCs sekretierten stabil menschliches SDF-1α-Protein, wie durch ELISA-Analyse (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) für menschliches SDF-1α bestimmt (ergänzende Abbildung 3d). Die Ergebnisse der SDF-eMSC-Karyotypisierung zeigten einen normalen menschlichen Karyotyp der SDF-eMSCs ohne Chromosomenanomalien, was auf die genetische Stabilität der SDF-eMSCs schließen lässt (ergänzende Abbildung 3e).

Um zu untersuchen, ob SDF-eMSCs das angiogene Potenzial von ECs steigern können, führten wir verschiedene Arten von experimentellen In-vitro-Analysen mit SDF-eMSCs durch. Um festzustellen, ob SDF-eMSCs die mit ECs und angiogenen Eigenschaften verbundene Genexpression beeinflussen, haben wir zunächst 30 % konditioniertes Medium (CM), das aus kultivierten SDF-eMSCs oder BM-MSCs geerntet wurde, 3 Tage lang mit den kultivierten hiPSC-ECs behandelt führten qRT-PCR-Analysen durch. Die Expressionsniveaus von stromal-abgeleitetem Faktor 1 alpha (SDF-1α), Tyrosinkinase mit Ig und Homologiedomäne 2 des epidermalen Wachstumsfaktors (Tie-2), vWF, E-Selectin (CD62) und interzellulärem Adhäsionsmolekül 1 ( ICAM-1) war bei den mit SDF-eMSC-CM behandelten hiPSC-ECs signifikant höher als bei den hiPSC-ECs, die BM-MSC-CM ausgesetzt waren (Abb. 2a). Es ist bekannt, dass insbesondere die erhöhte Expression von E-Selectin und ICAM-1 in Gegenwart aktivierter ECs an der Angiogenese beteiligt ist25,26,27,28,29. Als nächstes verstärkte in EC-Migrationstests, wie in Abb. 2 dargestellt, die Zugabe von konditionierten Medien aus den SDF-eMSCs (SDF-eMSC-CM) die Migration von hiPSC-ECs oder HUVECs im Vergleich zur Migration der damit behandelten ECs erheblich CM aus aus menschlichem Knochenmark stammenden MSCs (BM-MSC-CM), was darauf hindeutet, dass von den SDF-eMSCs freigesetzte Zytokine die Mobilität von ECs stärken (Abb. 2b und ergänzende Abb. 4a). Um zu testen, ob SDF-eMSCs das angiogene Potenzial von ECs direkt fördern, führten wir außerdem Matrigel-Röhrenbildungstests durch, ein repräsentatives Experiment zur Bewertung des Gefäßbildungspotenzials von Zellen. Die Ergebnisse der Matrigel-Röhrenbildungstests zeigten, dass die Anzahl der gebildeten Verzweigungen sowohl in den hiPSC-ECs als auch in den HUVECs, die mit 30 % CM behandelt wurden, das aus den kultivierten SDF-eMSCs geerntet wurde, deutlich größer war als die in den mit BM-MSC-CM behandelten ECs (Abb. 2c und ergänzende Abb. 4b). Interessanterweise förderte die Behandlung mit SDF-eMSC-CM nicht nur die Röhrenbildung durch die hiPSC-ECs, sondern trug auch zur Erhaltung der aus den hiPSC-ECs gebildeten Gefäße bei. Im Gegensatz zu den durch hiPSC-EC erzeugten Gefäßen, die BM-MSC-CM ausgesetzt waren und die innerhalb von 24 Stunden nach der Gefäßbildung begannen, die Gefäßstruktur zu zerstören, unterstützte die Behandlung mit SDF-eMSC-CM die Integrität der Gefäße bis zu 48 Stunden lang.

eine qRT-PCR-Analyse der relativen mRNA-Expression im Zusammenhang mit ECs und Angiogenese in den hiPSC-ECs, die mit konditionierten Medien (CM) aus kultivierten mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks (BM-MSC-CM) oder SDF-technisch hergestellten MSCs (SDF-eMSC-CM) behandelt wurden. CM) für 3 Tage. Die y-Achse stellt die relative mRNA-Expression von Zielgenen zur Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) dar. n = 3. *p < 0,05. b EC-Migrationstest. Repräsentative Bilder migrierter hiPSC-ECs und Quantifizierung der migrierten Fläche (%). Die hiPSC-ECs wurden in Transwells (oben) platziert, und reguläre Medien (EGM, EBM) oder die konditionierten Medien (CM), die aus verschiedenen Zellquellen (BM-MSC-CM und SDF-eMSC-CM) gesammelt wurden, wurden in Transwells platziert ( unten) für 7 Stunden. n = 3. *p < 0,05. c Röhrchenbildungstest. Die hiPSC-ECs wurden in mit Geltrex™ beschichteten 24-Well-Platten mit regulären Medien (EGM, EBM) oder konditionierten Medien (CM) (BM-MSC-CM und SDF-eMSC-CM) 9, 24 oder 48 Stunden lang kultiviert . Repräsentative Bilder der Röhrenbildung und Quantifizierungszusammenfassung für die Anzahl der Verbindungen. n = 3. *p < 0,05.

Um ein zelluläres Reservoir bereitzustellen, in dem SDF-eMSC-PAs ständig SDF-1α an MI-Herzen abgeben können, haben wir ein Pflaster hergestellt, das SDF-eMSC (SDF-eMSC-PA) einkapselt, indem wir SDF-eMSCs mit 2 % dezellularisiertem extrazellulärem Herz aus dem Herzen vermischt haben Matrix (hdECM)-basierter Bioink und lud ihn auf das Polycaprolacton (PCL)-Netz (Abb. 3 und ergänzende Abb. 5). Um anschließend zu bestätigen, ob SDF-eMSC-PAs funktionsfähig sind und SDF-1α effizient freisetzen können, haben wir SDF-eMSC-PAs 28 Tage lang in vitro kultiviert (ergänzende Abbildung 5a) und drei Tage lang zu verschiedenen Zeitpunkten Überstände gesammelt, um sie zu erzeugen die Freisetzungskinetik der SDF1α-eMSC-PAs mit dem SDF-1α ELISA-Kit. Die kumulative Freisetzungskurve zeigte, dass, obwohl die Anfangskonzentration von SDF-1α in den SDF-Cytokin-PAs (300 ng/ml) höher war als in den SDF-eMSC-PAs am Tag 0, im SDF kein SDF-1α nachweisbar war -Cytokin-PAs ab Tag 7. Allerdings stieg die Expression von SDF-1α, das von den SDF-eMSC-PAs freigesetzt wurde, bis zum 21. Tag kontinuierlich an (ergänzende Abbildung 5b), was darauf hindeutet, dass SDF-eMSCs kontinuierlich SDF-1α innerhalb des Pflasters sezernierten.

a Verfahren zur Herstellung eines Herzpflasters, das von SDF entwickelte MSCs (SDF-eMSC-PA) mit einer Polycaprolacton-Plattform (PCL) einkapselt, die durch ein 3D-Drucksystem hergestellt wird. b Optisches Bild innerhalb des hdECM-Patches. SDF-eMSC-PAs wurden zur Rückverfolgung mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff DiI vormarkiert. Maßstabsbalken: 1 mm. c Bild epikardial transplantierter SDF-eMSC-PAs im MI-induzierten Herzen. d Makroskopische Ansicht der Herzen 8 Wochen nach der PA-Transplantation.

Um abschließend zu bestimmen, ob die gleichzeitige Induktion von Vaskulogenese und Angiogenese durch Verwendung von hiPSC-ECs und SDF-eMSC-PAs zu einer umfassenden Gefäßregeneration und funktionellen Verbesserung in MI-induzierten Herzen führen könnte, induzierten wir MI durch LAD-Ligation nach der Bildung von fünf Versuchsgruppen wie folgt: (1) MI-Kontrolle, (2) SDF-eMSC-PA implantiertes Epikard von MI-Herzen (nur PA, 1 × 106), (3) hiPSC-ECs, intramyokardiale Injektion (nur EC, 1 × 106) und (4) kombinierte Plattform aus hiPSC-ECs und SDF-eMSC-PA (EC + PA, jeweils 1 × 106) (Abb. 4). Wir führten erstmals eine serielle Echokardiographie für alle Versuchsgruppen vor, 2, 4 und 8 Wochen nach der Zellbehandlung durch. Alle Versuchsgruppen waren im Vergleich zur Scheingruppe signifikant reduziert (ergänzende Abbildung 6a – g). Interessant ist, dass die Herzfunktion in der EC + PA-Gruppe bis zu 8 Wochen im Vergleich zur Herzfunktion vor der Studie signifikant erhalten blieb, während die Herzfunktion in anderen Gruppen, wie der Kontrollgruppe, der Gruppe mit hiPSC-EC allein und der Gruppe mit SDF-eMSC-PA allein, bis zur 8. Woche kontinuierlich verringert. (Abb. 4a–d). Die durch LVIDd, LVIDs, SWT, PWT und RWT ermittelte unerwünschte kardiale Umgestaltung war in der EC + PA-Gruppe im Vergleich zu den anderen Gruppen deutlich reduziert (Abb. 4e – i und ergänzende Abb. 6h). Um die Herzfunktion genauer zu bewerten, führten wir hämodynamische Messungen des LV mit einem invasiven Druck-Volumen-Katheter (PV) durch, der den hämodynamischen Druck und das Volumen des LV messen kann. Die Ergebnisse der PV-Schleife 8 Wochen nach der Zellbehandlung zeigten, dass die EC + PA-Gruppe im Vergleich zu den anderen Gruppen eine deutlich verbesserte Herzfunktion aufwies und nachteilige Herzumgestaltungen verhinderte (Abb. 5). Die beiden Parameter der allgemeinen Herzfunktion, Schlagvolumen (SV) und Herzzeitvolumen (CO), waren signifikant höher (Abb. 5a–c) und das maximale Volumen (V max), das den am Maximum gemessenen kardialen Remodelling-Index darstellt Diastole war in der EC + PA-Gruppe signifikant niedriger als in den anderen Gruppen (Abb. 5d). Obwohl sich der bei der maximalen Systole gemessene maximale Druck (P max) zwischen den Gruppen nicht wesentlich unterschied, wurden die maximale Druckänderungsrate (dP/dtmax) und die minimale Druckänderungsrate (dP/dtmin) angegeben, die die Druckänderung in anzeigen LV pro Sekunde waren in der EC + PA-Gruppe erhöht. (Abb. 5e – f und ergänzende Abb. 7a). Die zeitliche Variation der verschlossenen Vena cava inferior (IVC) wurde verwendet, um die belastungsunabhängige intrinsische Kontraktibilität des Herzens zu bewerten. Die enddiastolische Druck-Volumen-Beziehung (EDPVR), die auf das Fehlen einer diastolischen Dysfunktion hinweist, unterschied sich zwischen den Gruppen nicht, wohingegen die Steigung der postsystolischen Druck-Volumen-Beziehung (ESPVR), die auf die Kontraktibilität des Herzens hinweist, deutlich verbessert war in der EC + PA-Gruppe im Vergleich zu den anderen Gruppen (Abb. 5g – h und ergänzende Abb. 7b). Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse aus hämodynamischen LV-Messungen konsistent, dass die Behandlung mit der kombinierten Plattform mit hiPSC-ECs und SDF-eMSC-PAs die Herzreparatur bei MI-Herzen verbessert.

a Linksventrikuläre Ejektionsfraktion (EF). b EF-Delta-Änderung 8 Wochen nach der Zellbehandlung. c Linke fraktionierte Verkürzung (FS). d FS-Delta-Änderung 8 Wochen nach der Zellbehandlung. e Linksventrikuläre interne diastolische Dimension (LVIDd). f Linksventrikuläre interne systolische Dimension (LVIDs). g Septumwandstärke (SWT). h Hintere Wandstärke (PWT). i Relative Wandstärke (RWT). n = 6–11. *p < 0,05.

a Repräsentative Bilder der hämodynamischen Druck- und Volumenkurve (PV) im Steady State 8 Wochen nach der Zellbehandlung. b Schlagvolumen (SV). c Herzzeitvolumen (CO). d Volumen max (V max) definiert das Blutvolumen im linken Ventrikel am Ende der Diastole. e dP/dtmax bezieht sich auf die maximale Druckänderungsrate während der Systole. f Die minimale Druckänderungsrate während der Diastole (dP/dtmin). g Steigung der End-systolischen Druck-Volumen-Beziehung (ESPVR), die die intrinsische Herzkontraktibilität anzeigt, gemessen durch vorübergehenden Verschluss der Vena cava inferior (IVC). h Steigung der enddiastolischen Druck-Volumen-Beziehung (EDPVR). n = 4. *p < 0,05.

Als nächstes untersuchten wir das In-vivo-Verhalten intramyokardial implantierter hiPSC-ECs in Gegenwart oder Abwesenheit von SDF-eMSC-PAs. Da hiPSC-ECs ständig GFP exprimieren, konnten wir ihr Schicksal in Herzgewebeschnitten verfolgen. Die konfokale mikroskopische Untersuchung von Herzgewebe, das 8 Wochen nach der Zellbehandlung entnommen wurde, zeigte, dass die Implantation von SDF-eMSC-PAs die Retention und Transplantation von intramyokardial injizierten GFP-positiven hiPSC-ECs deutlich verbesserte. Quantitativ war der Anteil GFP-positiver hiPSC-ECs in der EC + PA-Gruppe wesentlich höher als in der EC-Gruppe (Abb. 6a). Interessanterweise waren die hiPSC-ECs in der Gruppe mit hiPSC-ECs allein in der Nähe der Injektionsstellen lokalisiert, während die hiPSC-ECs in der Gruppe mit EC + PA über die Regionen des linken Ventrikels verteilt waren. Angesichts der Fähigkeit von SDF-eMSC-PAs, das Überleben und die Retention injizierter hiPSC-ECs zu verbessern, wollten wir untersuchen, ob SDF-eMSC-PAs in vitro direkte zytoprotektive Wirkungen in hiPSC-ECs ausüben. Eine ischämische Verletzung wurde simuliert, indem hiPSC-ECs H2O2 (500 µM) ausgesetzt wurden. Die Verabreichung von CM aus SDF-eMSCs (SDF-eMSC-CM) verbesserte die Lebensfähigkeit sowohl von hiPSC-ECs als auch von HUVECs erheblich, wie durch den LIVE/DEAD-Assay und den CCK-8-Assay bestimmt (ergänzende Abbildung 8a – f). Die Behandlung mit SDF-eMSC-CM erhöhte die Anzahl lebensfähiger Zellen erheblich, was darauf hindeutet, dass SDF-eMSC-CM direkte zytoprotektive Wirkungen auf ECs gegen ischämische Beleidigungen ausübt. Anschließend führten wir gründliche histologische Analysen mit Herzgewebe durch, das 8 Wochen nach der Zellbehandlung entnommen wurde, um zu untersuchen, ob SDF-eMSC-PAs gleichzeitig die hPSC-EC-abhängige Vaskulogenese sowie die Angiogenese der Blutgefäße des Wirts fördern können. Mit Rhodamin konjugiertes IB4 wurde systemisch injiziert, um das funktionelle Endothel in diesen Experimenten zu identifizieren. Konfokale Bilder zeigten zunächst, dass die Anzahl der gesamten IB4-positiven (IB4+) Kapillaren sowohl in der Grenzzone als auch in der Infarktzone der Herzen in der EC + PA-Gruppe wesentlich höher war als in den anderen Gruppen, einschließlich der EC-Gruppe (Abb . 6b). Die Anzahl der Gefäße, die GFP-negativ, aber positiv für IB4 (GFP-/IB4+) waren, war ebenfalls signifikant höher als in anderen Gruppen, einschließlich der Nur-EC-Gruppe (Abb. 6c). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der kombinierte Ansatz die Angiogenese von Wirtsgefäßen in MI-Herzen signifikant förderte. Noch wichtiger ist, dass die Anzahl der durch hiPSC-ECs-GFP+ gebildeten De-novo-Gefäße in der EC + PA-Gruppe wesentlich höher war als in der reinen EC-Gruppe, was darauf hindeutet, dass SDF-eMSC-PAs die hiPSC-EC-abhängige Vaskulogenese erleichtern (Abb. 6d–e und ergänzende Abb. 9a). Bemerkenswert ist, dass die Anzahl größerer Blutgefäße (Durchmesserbereich: > 5 μm), einer der Indikatoren für funktionelle Blutgefäße in der EC + PA-Gruppe, deutlich höher war als in der EC-Gruppe. Interessanterweise zeigten viele dieser größeren Gefäße in der EC + PA-Gruppe eine reichliche Expression von α-SMA, einem Marker für glatte Muskelzellen, was darauf hindeutet, dass diese größeren Gefäße (CD31+/α-SMA+) arteriolenähnliche Gefäße sein könnten, was darauf hindeutet SDF-eMSC-PA spielte bestimmte Rollen beim Einwachsen und Reifen von Gefäßen (Abb. 6e – g und ergänzende Abb. 9b).

ein repräsentatives Bild von hiPSC-ECs-GFP im Infarktbereich 8 Wochen nach der Zellbehandlung und deren Quantifizierungszusammenfassung. n = 3. *p < 0,05. Maßstabsbalken: 1000 µm. b Repräsentative Bilder von mit IB4-Rhodamin (rot) gefärbten Blutgefäßen in der Infarktzone (IZ), der Grenzzone (BZ) und der entfernten Zone 8 Wochen nach der Zellbehandlung und eine Zusammenfassung ihrer Quantifizierung. n = 5–7. *p < 0,05. Maßstabsbalken: 100 µm. c Repräsentative Bilder von Blutgefäßen, die im Infarktbereich negativ für GFP, aber positiv für IB4 (GFP-/IB4+) sind, und deren Quantifizierungszusammenfassung. hiPSC-ECs-GFP (grün), IB4-Rhodamin (rot) und DAPI (blau). n = 5. *p < 0,05. Maßstabsbalken: 20 µm. d, e Repräsentative Bilder von GFP- und IB4 (GFP+/IB4+)-positiven Blutgefäßen im Infarktbereich und deren Quantifizierung. hiPSC-ECs-GFP (grün), IB4-Rhodamin (rot) und DAPI (blau). n = 5. *p < 0,05. Maßstabsbalken: 20 µm. f, g Durchmesser von hiPSC-EC-abgeleiteten GFP-positiven Blutgefäßen im Infarktbereich und in der Grenzzone. n = 5. *p < 0,05.

Um weiter zu untersuchen, ob die durch die kombinierte Plattform (EC + PA) erreichte Gefäßregeneration ausreichte, um das Myokard vor einem ischämischen Insult zu retten, quantifizierten wir das lebensfähige Myokard durch Immunfärbung auf kardiales Troponin T (cTnT)-Antikörper unter Verwendung der aus allen Experimenten entnommenen Herzgewebe Gruppen 8 Wochen nach der Zellbehandlung. Die Anzahl lebensfähiger cTnT+-Kardiomyozyten war in der EC + PA-Gruppe signifikant höher als in den anderen Gruppen (Abb. 7a). Diese Ergebnisse histologischer Analysen unter Verwendung von Herzgewebe motivierten uns zu testen, ob SDF-eMSCs (ergänzende Abbildung 10a) in vitro direkte zytoprotektive Wirkungen auf Kardiomyozyten gegen ischämische Beleidigungen ausüben können. Eine ischämische Schädigung wurde simuliert, indem Kardiomyozyten H2O2 (500 µM) ausgesetzt wurden. Die Ergebnisse sowohl des LIVE/DEAD-Assays als auch des Cholecystokinin-8 (CCK-8)-Assays zeigten, dass die Verabreichung von SDF-eMSC-konditionierten Medien (CM) die Lebensfähigkeit kultivierter Kardiomyozyten, die aus neugeborenen Ratten (NRCM) isoliert wurden, gegenüber H2O2 deutlich verbesserte Behandlung im Vergleich zu anderen Behandlungen. Diese Ergebnisse legen auch nahe, dass SDF-eMSCs direkte zytoprotektive Wirkungen gegen ischämische Beleidigungen haben (ergänzende Abbildung 11a – c).

a Repräsentative Immunfärbungsbilder des mit cTnT (grün) und DAPI (blau) gefärbten Myokards 8 Wochen nach der Zellbehandlung und Quantifizierung der Anzahl cTnT-positiver Kardiomyozyten. Mit DiI markierte SDF-eMSCs innerhalb des Herzpflasters (rot) n = 5. *p < 0,05. Maßstabsbalken: 300 µm. b Repräsentative Bilder der Masson-Trichrom-Färbung unter Verwendung von Herzgewebe, das 8 Wochen nach der Zellbehandlung entnommen wurde. c, d Quantifizierungszusammenfassung eines Prozentsatzes von Fibrose und lebensfähigem Myokard. n = 5. *p < 0,05. Maßstabsbalken: 2000 µm.

Folglich zeigte die kombinierte Behandlungsgruppe einen signifikanten Rückgang der Herzfibrose. Die Ergebnisse der Masson-Trichrom-Färbung unter Verwendung von nach 8 Wochen entnommenem Herzgewebe zeigten eine Fibrosefläche (%), die in den kombinierten Behandlungsgruppen signifikant geringer war als in den anderen Gruppen (Abb. 7b–d). Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse eindeutig darauf hin, dass die kombinierte Behandlung zu einer umfassenden Herzreparatur durch verbesserte Gefäßregeneration führte und dass die SDF-eMSCs zumindest teilweise zum indirekten Schutz des Myokards vor ischämischen Verletzungen durch konsistente Sekretion zytoprotektiver SDF-Zytokine beitrugen.

In der vorliegenden Studie haben wir versucht, eine vielschichtige Strategie zu entwickeln, um eine wirksame therapeutische Neovaskularisierung durch den Einsatz von hiPSC-ECs und SDF-eMSCs zu erreichen, möglicherweise durch gleichzeitige Induktion sowohl der postnatalen Vaskulogenese als auch der Angiogenese (Abb. 8). Wir beobachteten, dass intramyokardial injizierte hiPSC-ECs über einen postnatalen Vaskulogenesemechanismus zur erfolgreichen Bildung von De-novo-Gefäßen führten, wohingegen epikardial implantierte SDF-eMSC-PAs die Angiogenese bestehender Wirtsgefäße aus dem MI-Herz sowie der neu gebildeten Gefäße wirksam förderten die injizierten hiPSC-ECs über die kontinuierliche Sekretion proangiogener Zytokine, insbesondere SDF-1α.

Die Verbesserung der Herzfunktion und die umfassende Gefäßregeneration werden durch die kombinierte Plattform mit hiPSC-ECs und SDF-eMSC-PAs erreicht.

Offenbar boten die SDF-eMSC-PAs eine günstige Mikroumgebung für die intramyokardial injizierten hiPSC-ECs, was deren Überleben, Migration und Retention in den ischämischen Herzen verbesserte. Noch wichtiger ist, dass die SDF-eMSC-PAs im Wesentlichen die nachfolgende Gefäßreifung vom primitiven Zustand der durch die hiPSC-ECs gebildeten De-novo-Gefäße zu größeren funktionell perfundierbaren Gefäßen induzierten. Zusammengenommen führten diese synergistischen Effekte der hiPSC-ECs und SDF-eMSC-PAs letztendlich zu einer vollständigen Gefäßregeneration in MI-exponierten Herzen. Tatsächlich wurde in zahlreichen früheren Studien eine therapeutische Neovaskularisierung versucht, die entweder auf die Vaskulogenese oder die Angiogenese getrennt mit mehreren Zelltypen abzielt, darunter EPCs, hMSCs oder kardiale Vorläuferzellen11,30,31,32,33. Im Vergleich zu früheren Studien ist diese Studie nach unserem besten Wissen die erste, die eine inklusive Neovaskularisation durch die gemeinsame Induktion von Vaskulogenese und Angiogenese induziert, indem zwei unterschiedliche Hauptstammzelltypen verwendet werden, die über zwei unterschiedliche Wege zugeführt werden.

Um eine postnatale Vaskulogenese in MI-Herzen zu erreichen, verwendeten wir hiPSC-ECs, hauptsächlich aufgrund ihres relativ größeren vaskulogenen Potenzials und ihrer Ähnlichkeiten mit menschlichen primären ECs hinsichtlich der Expression endothelspezifischer Gene und Strukturproteine sowie physiologischer Eigenschaften wie Röhrenbildung, LDL-Aufnahme und Kapillarbildung in vivo. Mehrere präklinische Studien haben gezeigt, dass hPSC-ECs zur erfolgreichen Transplantation, Ausrichtung und Kopplung mit Wirtskapillaren verwendet werden können, um die Vaskularität zu erhöhen34,35. Noch wichtiger ist, dass hPSC-ECs die Durchblutung in Ischämiemodellen der Hinterbeine wiederherstellten und die Wundheilung beschleunigten, wodurch sie eine ideale Zellquelle zur Behandlung von Gefäßerkrankungen darstellten36,37,38. Obwohl vermutet wird, dass hPSC-ECs ein vergleichsweise höheres vaskulogenes Potenzial besitzen als andere zuvor untersuchte Zelltypen, zeigen die aktuelle Studie und andere durchweg, dass die Behandlung nur mit hPSC-ECs möglicherweise nicht ausreicht, um eine ausreichende Anzahl neuer Blutgefäße in der Ischämie zu erzeugen Herz aufgrund der äußerst feindseligen Umgebung im MI-Herzen, was auf die Notwendigkeit zusätzlicher Unterstützung schließen lässt. Um die hiPSC-EC-basierte Vaskulogenese zu fördern und die Angiogenese aus Wirtsgefäßen zu induzieren, stellten wir daher ein Herzpflaster her, indem wir SDF-eMSCs einkapselten, die gentechnisch verändert wurden, um kontinuierlich SDF-1α freizusetzen.

SDF-1α wurde als Hauptinduktor der myokardialen Angiogenese ausgewählt, da dieses Molekül eng an mehreren physiologischen Phänomenen in ECs beteiligt ist, wie z. B. Zellproliferation, Überleben, Migration, Angiogenese und antiapoptotischen Wirkungen 39, 40. Dennoch ist der therapeutische Einsatz von SDF-1α durch seine kurze Halbwertszeit begrenzt41. Aus diesem Grund haben wir menschliche BM-MSCs entwickelt, um die kontinuierliche Freisetzung von SDF-1α mithilfe eines lentiviralen Vektors zu erleichtern, der die Reprogrammierungsfaktoren hTERT und c-Myc kodiert. Wir haben gezeigt, dass die Behandlung konditionierter Medien von SDF-eMSCs mit den kultivierten hiPSC-ECs und HUVECs deren angiogenes Potenzial deutlich verbesserte, wie z. B. eine verstärkte Expression mehrerer angiogenesebezogener Gene, EC-Proliferation, Migration und Röhrenbildung. Um eine anhaltende Sekretion von SDF-1α und anderen günstigen parakrinen Faktoren in Richtung des verletzten Myokards sicherzustellen, haben wir von hdECM abgeleitete Herzpflaster erzeugt, die als Zellreservoir im Infarktbereich dienen. Um die Herzpflaster herzustellen, haben wir eine innovative Strategie entwickelt, die die Herstellung von lyophilisiertem Schweine-hdECM umfasst, das für die bequeme Lagerung und den einfachen Transport zellfreier ECMs gemischt mit SDF-eMSCs als Biotinte optimiert ist. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die SDF-eMSCs innerhalb des Pflasters bis 8 Wochen nach der Behandlung offenbar besser überlebten, was durch die höhere Anzahl an DiI-positiven MSCs belegt wurde. Die überlebenden SDF-eMSCs sezernierten ständig nützliche parakrine Faktoren und förderten die Gefäßregeneration, indem sie die hiPSC-EC-abhängige Vaskulogenese und Angiogenese förderten und letztendlich das verletzte Myokard verjüngten.

Tatsächlich gehören ein erheblicher Zelltod und schlechte Transplantationsraten nach der Transplantation in das Wirtsmyokard zu den kritischsten Hürden, die die zellbasierte Gefäßregeneration im ischämischen Herzen einschränken. Interessanterweise zeigten unsere histologischen Analysen einen erheblichen Anstieg der Retention und Transplantation intramyokardial injizierter hiPSC-ECs, was in Kombination mit epikardialen SDF-eMSC-PAs eine robuste und stabile Gefäßregeneration induzierte. Umgekehrt führte das Fehlen von SDF-eMSC-PAs über einen Zeitraum von 8 Wochen zu einem raschen Rückgang der Anzahl von hiPSC-ECs. Im Gegensatz dazu erhöhte seine Anwesenheit die Anzahl der überlebenden hiPSC-ECs für die anschließende Gefäßbildung erheblich. Somit ermöglichten die von SDF-eMSC-PAs sezernierten parakrinen Faktoren zunächst eine schnelle Stabilisierung der injizierten hPSC-ECs und verbesserten das Überleben und die Transplantation von hiPSC-ECs, insbesondere im frühen Stadium der Implantation. Die höhere Transplantationsrate ist besonders wichtig, da der Erfolg der zellbasierten Gefäßregeneration weitgehend von der Anzahl der Zellen abhängt, die überleben und sich im Herzen vermehren42.

Darüber hinaus fördern SDF-eMSC-PAs nicht nur die Gefäßregeneration, sondern tragen auch zur Gefäßvergrößerung sowie zum Übergang zu funktionsfähigen Blutgefäßen bei, was als Anfangsstadium der Blutgefäßreifung definiert werden kann. Die histologische Analyse ergab, dass die Anzahl der Blutgefäße mit einem physiologisch und funktionell wichtigen Durchmesser von > 5 μm sowohl im Infarkt als auch in den Grenzzonen im Herzen der EC + PA-Gruppe wesentlich höher war als in anderen Experimenten Gruppen, einschließlich der hiPSC-EC-Monogruppe. Als zusätzlicher Beweis deuteten die Ergebnisse des In-vitro-Matrigel-Plug-Assays darauf hin, dass die Behandlung mit konditionierten Medien, die von den SDF-eMSCs stammen, die Integrität der von hiPSC-EC abgeleiteten Gefäße im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollgefäßen länger als 48 Stunden aufrechterhielt. Interessanter ist, dass die SDF-eMSC-PAs offenbar die Arterialisierung von Blutgefäßen induzierten, möglicherweise durch Stimulierung der Migration und Rekrutierung glatter Muskelzellen, da die Anzahl der Gefäße, die sowohl für CD31 als auch für α-SMA positiv waren, im EC + PA deutlich höher war Gruppe als in den anderen Versuchsgruppen. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse deutlich, dass SDF-eMSC-PA wesentlich zur Gefäßstabilität und -integrität beiträgt.

Zusammenfassend schlagen wir eine neuartige Strategie für die Gefäßregeneration in ischämischen Herzen durch hiPSC-ECs und SDF-eMSC-PA-Induktion vor, die nicht nur die hiPSC-EC-basierte Vaskulogenese fördert, sondern auch die Angiogenese von Gefäßen in den infarktierten Herzen des Wirts stimuliert. Daher kann unsere neuartige Therapiestrategie, die auf einem dualen System basiert, zur Gefäßregeneration und Herzreparatur eingesetzt werden.

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Diese Forschung wurde vom Ministerium für Gesundheit und Soziales (#HI20C0184 an SHM), dem Korea Fund for Regenerative Medicine (#21A0403L1 an SJP und #NRF-2021M3E5E5096524 für JJ) und dem Ministerium für Lebensmittel- und Arzneimittelsicherheit (#18172MFDS182 an HJP) unterstützt ) und das Stipendium des Bio & Medical Technology Development Program (#NRF-2017M3A9B3061954 an HJP). Diese Studie wurde auch vom Hong Kong Research Grants Council (21100818 an KB), dem CityU Applied Research Grant (ARG an KB) und dem TFBC-Projektfonds (KB) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Hyeok Kim, Soon-Jung Park, Jae-Hyun Park.

Abteilung für Biomedizin und Gesundheitswissenschaften, Medizinische Fakultät, Katholische Universität Korea, Seoul, Südkorea

Hyeok Kim, Jae-Hyun Park, Bong-Woo Park, Ji-Won Hwang, Jin-Ju Kim, Woo-Sup Sim und Hun-Jun Park

Abteilung für Kardiologie, Abteilung für Innere Medizin, Seoul St. Mary's Hospital, The Catholic University of Korea, Seoul, Südkorea

Hyeok Kim, Bong-Woo Park, Ji-Won Hwang, Jin-Ju Kim, Woo-Sup Sim und Hun-Jun Park

Forschungsinstitut, T&R Biofab Co., Ltd., Siheung, Südkorea

Soon-Jung Park & Sung-Hwan Moon

Abteilung für Biomedizinische Wissenschaften, City University of Hong Kong, Kowloon Tong, Hongkong

Jae-Hyun Park, Sunghun Lee und Kiwon Ban

SL BIGEN, Inc., Seongnam, Südkorea

Bald Min Lee und Hyo-Jin Kim

Abteilung für kreatives IT-Engineering und School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology, Pohang, Südkorea

Byeongmin Kang & Jinah Jang

Abteilung für Urologie, Medizinische Fakultät, Katholische Universität Korea, Seoul, Südkorea

Seung Hwan Jeon

Abteilung für Kardiologie, Abteilung für Innere Medizin, Katholische Universität Korea, Seoul, Südkorea

Dong-Bin Kim

Fakultät für Maschinenbau, Pohang University of Science and Technology, Pohang, Südkorea

Dong-Woo Cho

Abteilung für Tierbiotechnologie, Sangji-Universität, Wonju, Südkorea

Sung-Hwan Moon

Forschungszentrum für Zelltodkrankheiten, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Südkorea

Hun-Jun-Park

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Korrespondenz mit Sung-Hwan Moon, Hun-Jun Park oder Kiwon Ban.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kim, H., Park, SJ., Park, JH. et al. Verbesserungsstrategie für eine effektive Gefäßregeneration nach einem Myokardinfarkt durch einen dualen Stammzellansatz. Exp Mol Med 54, 1165–1178 (2022). https://doi.org/10.1038/s12276-022-00827-8

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Eingegangen: 07. Dezember 2021

Überarbeitet: 08. März 2022

Angenommen: 21. März 2022

Veröffentlicht: 16. August 2022

Ausgabedatum: August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s12276-022-00827-8

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Verbesserungsstrategie für eine effektive Gefäßregeneration nach einem Myokardinfarkt durch einen dualen Stammzellansatz