Charakterisierung von Antibiotika-Resistomen durch umprogrammierte Bakteriophagen

Nature Microbiology Band 8, Seiten 410–423 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die funktionelle Metagenomik ist ein leistungsstarkes experimentelles Instrument zur Identifizierung von Antibiotikaresistenzgenen (ARGs) in der Umwelt, die Auswahl geeigneter Wirtsbakterienarten ist jedoch begrenzt. Diese Einschränkung betrifft sowohl den Umfang der identifizierten ARGs als auch die Interpretation ihrer klinischen Relevanz. Hier präsentieren wir eine funktionelle Metagenomik-Pipeline namens Reprogrammed Bacteriophage Particle Assisted Multi-species Functional Metagenomics (DEEPMINE). Dieser Ansatz kombiniert und verbessert die Verwendung von T7-Bakteriophagen mit ausgetauschten Schwanzfasern und gezielter Mutagenese, um die Spezifität und Effizienz des Phagenwirts für die funktionelle Metagenomik zu erweitern. Diese modifizierten Phagenpartikel wurden verwendet, um große metagenomische Plasmidbibliotheken in klinisch relevante bakterielle Krankheitserreger einzuführen. Durch das Screening auf ARGs in Boden- und Darmmikrobiomen und klinischen Genomen gegen 13 Antibiotika zeigen wir, dass dieser Ansatz die Liste der identifizierten ARGs erheblich erweitert. Viele ARGs haben artspezifische Auswirkungen auf die Resistenz; Sie sorgen bei einer Bakterienart für ein hohes Maß an Resistenz, bei einer verwandten Art jedoch nur für eine sehr begrenzte Resistenz. Schließlich haben wir mobile ARGs gegen Antibiotika identifiziert, die sich derzeit in der klinischen Entwicklung befinden oder kürzlich zugelassen wurden. Insgesamt erweitert DEEPMINE die Toolbox der funktionalen Metagenomik zur Untersuchung mikrobieller Gemeinschaften.

Die Metagenomik ermöglicht die umfassende Analyse mikrobieller Gemeinschaften, einschließlich Arten, die nicht unter Laborbedingungen kultiviert werden können. Durch die Extraktion genomischer Daten aus Umweltproben gewinnen Forscher Erkenntnisse über die Artenzusammensetzung und Funktionalität des Mikrobioms in einer Reihe natürlicher Umgebungen1. Die funktionelle Metagenomik widmet sich insbesondere dem Screening metagenomischer DNA auf das Vorhandensein von Genen, die spezifische molekulare Funktionen kodieren2,3,4. Das Klonen und Exprimieren fragmentierter metagenomischer DNA in einem bakteriellen Wirt kann bisher unbeschriebene Proteine freilegen. Zu den Anwendungen der funktionellen Metagenomik gehören die Identifizierung von Enzymen, die Erforschung bioaktiver Wirkstoffe und das Screening auf in der Umwelt vorkommende Antibiotikaresistenzgene5,6,7,8. Die Bibliotheken enthalten typischerweise Millionen von DNA-Fragmenten, was einer Gesamtabdeckung von 5–100 GB entspricht, der Größe von Tausenden von Bakteriengenomen7,9,10.

Obwohl die funktionelle Metagenomik möglicherweise für mehrere Forschungsbereiche nützlich sein kann, ist die Methodik in ihrer gegenwärtigen Form alles andere als perfekt, was ihre Anwendbarkeit einschränkt. Angesichts der enormen Größe der Plasmidbibliotheken ist die effiziente Einführung dieser Bibliotheken in einen Bakterienwirt von zentraler Bedeutung. Dieser Prozess – typischerweise durch Elektroporation, Konjugation oder herkömmliche Bakteriophagentransduktion – ist jedoch umständlich und nur für eine begrenzte Anzahl von Laborstämmen effizient11,12. Diese Einschränkung hat weitreichende Konsequenzen für die Anwendbarkeit funktioneller metagenomischer Screenings und die Allgemeingültigkeit der Schlussfolgerungen, die daraus gezogen werden können13,14. Es behindert beispielsweise das Screening nach biotechnologisch oder klinisch relevanten Genen, die nur in bestimmten Bakterienarten funktionsfähig sind 12,15,16. Insbesondere basieren die meisten metagenomischen Screenings auf Antibiotikaresistenzgene (ARGs) stark auf der Verwendung von Laborstämmen von Escherichia coli als bakteriellen Wirten5,17,18. Daher bleiben ARGs, die bei diesen Stämmen keine Resistenz hervorrufen, dies aber bei anderen klinisch relevanten Krankheitserregern der Fall ist, nicht nachweisbar. Tatsächlich deuten frühere Studien darauf hin, dass der Einfluss von Antibiotikaresistenzmutationen auf Resistenzphänotypen vom genetischen Hintergrund des Bakterienwirts abhängt19. Darüber hinaus könnten metagenomische Screenings in mehreren Wirtsbakterien wertvolle Informationen über die funktionelle Kompatibilität und Mobilität von ARGs zwischen den Spezies liefern20.

In diesem Artikel stellen wir Reprogrammed Bacteriophage Particle Assisted Multi-species Functional Metagenomics (DEEPMINE) vor, das eine Lösung für diese Probleme bietet (Abb. 1a). DEEPMINE basiert auf einer früheren Arbeit, die darauf abzielte, den Wirtsbereich von T7-Phagenpartikeln für die DNA-Transduktion durch den Austausch der Schwänze zwischen verschiedenen Arten von Bakteriophagen zu erweitern21. DEEPMINE verwendet solche modifizierten Bakteriophagen-transduzierenden Partikel, um große metagenomische Plasmidbibliotheken in eine Reihe von Bakterienarten einzuschleusen. Darüber hinaus haben wir gezielte Laborentwicklung eingesetzt, um die Effizienz einer solchen Bibliotheksbereitstellung zu steigern22. Mit diesem Ansatz führten wir metagenomische Screenings bei klinisch relevanten bakteriellen Krankheitserregern aus der Familie der Enterobacteriaceae durch. Wir haben mehrere bisher nicht gemeldete ARGs mit artspezifischen Auswirkungen auf die Antibiotika-Empfindlichkeit identifiziert. Darüber hinaus haben wir eine Reihe von Antibiotika untersucht, die erst kürzlich für den klinischen Einsatz zugelassen wurden oder sich in einem späten klinischen Entwicklungsstadium befinden, und zeigen, dass diese neuen Antibiotika nach jahrzehntelanger klinischer Anwendung genauso anfällig für Resistenzbildung sind wie alte Antibiotika (Erweiterte Daten). Tabelle 1).

a, Schematischer Überblick über DEEPMINE. DEEPMINE nutzt hybride T7-Bakteriophagen-transduzierende Partikel und gerichtete Evolution, um die Spezifität und Effizienz des Phagenwirts für die funktionelle Metagenomik in klinischen Zielstämmen zu verändern. Umwelt-DNA in Form einer metagenomischen Plasmidbibliothek wird dann in diese Bakteriophagenpartikel verpackt und in die interessierenden Wirte transduziert. Die vergleichende Analyse von Screening-Treffern wird durch eine PCR-freie DNA-Fragment-Sequenzierungspipeline mit doppeltem Barcode ermöglicht. b: Die Transduktion der funktionellen metagenomischen Bibliothek durch spezifische hybride T7-Bakteriophagenpartikel ist mindestens so effizient wie die Elektroporation (Elektroporation in E. coli vs. Transduktion in K. pneumoniae P = 0,010545, einseitiger t-Test mit zwei Proben, n = 3 biologisch unabhängig Experimente; Elektroporation in E. coli vs. Transduktion in S. enterica P = 0,15, einseitiger t-Test mit zwei Stichproben, n = 3 biologisch unabhängige Experimente; Ergänzungstabelle 2). Mittelwert ± Standardabweichung c,d, gelieferte metagenomische DNA-Fragmentlängen (c) und Diversitäten (d), bestimmt durch PCR-freie Long-Read-Deep-Sequenzierung direkt nach Elektroporation und Transduktion (Methoden). Gestrichelte Linien stellen die durchschnittliche Größe der DNA-Fragmente dar. Shannon-Alpha-Diversitätsindizes (H) wurden auf der Grundlage der Häufigkeit von Fragmenten mit identischen Sequenzen in den Bibliotheken berechnet (siehe Methoden, n = 276.899, n = 188.317 und n = 180.497 für E. coli, K. pneumoniae und S. enterica). ; Ergänzungstabelle 3). Bitte beachten Sie, dass nur ein Bruchteil der gelieferten Bibliotheken sequenziert wurde.

Wir haben zunächst getestet, ob hybride T7-Bakteriophagenpartikel mit ausgetauschten Schwanzproteinen geeignete Werkzeuge sind, um funktionelle metagenomische Plasmidbibliotheken in Bakterienkulturen zu transportieren. Kurz gesagt, wir haben metagenomische Bibliotheken erstellt, um Umwelt- und klinische Resistome23 zu erhalten, darunter (1) Flusssediment- und Bodenproben von sieben mit Antibiotika kontaminierten Industriestandorten in unmittelbarer Nähe von Antibiotika-Produktionsanlagen in Indien (d. h. anthropogenes Bodenmikrobiom)24,25 , (2) Stuhlproben von 10 europäischen Personen, die vor der Probenspende mindestens ein Jahr lang keine Antibiotika eingenommen hatten (d. h. Darmmikrobiom) und (3) Proben aus einem Pool von 68 multiresistenten Bakterien, die in Gesundheitseinrichtungen isoliert wurden oder aus Stammsammlungen gewonnen werden (d. h. klinisches Mikrobiom; siehe Methoden, Abb. 1a und Ergänzungstabelle 1).

DNA-Fragmente mit einer Größe von 1,5 bis 5 kb wurden in ein Klonierungsplasmid mit geringer Kopienzahl kloniert, das in ausgewählten Ordnungen der Klasse Gammaproteobacteria26 replizieren kann (siehe Methoden). Die Plasmid-DNA trägt eine Verpackungssignalsequenz, die die Translokation des Plasmids in den T7-Bakteriophagen unabhängig vom T7-Genom ermöglicht (Abb. 1a). Jede erstellte Bibliothek enthielt 3–5 Millionen DNA-Fragmente, was einer Gesamtabdeckung von 25 GB (d. h. der Größe von etwa 5.000 Bakteriengenomen) entspricht. Die resultierenden Plasmidbibliotheken wurden in zwei zuvor charakterisierte Hybrid-T7-Phagenpartikel verpackt, die Schwanzfaserproteine des Salmonella-Phagen ΦSG-JL2 und des Klebsiella-Phagen K1121 präsentieren. Die drei metagenomischen Bibliotheken wurden in Salmonella enterica subsp. transduziert. enterica Serovar Typhimurium str. LT2 und K. pneumoniae NCTC 9131, beide bekannte bakterielle Ziele dieser beiden hybriden T7-Bakteriophagenpartikel21. Parallel dazu haben wir die Bibliotheken im Modellbakterium E. coli K12 elektroporiert (Methoden). Abschließend haben wir analysiert, ob die Transduktion durch T7-Phagenpartikel zu einer Verzerrung der Größe und Zusammensetzung der Bibliotheken führt (Methoden).

Bemerkenswerterweise lieferten sowohl die ΦSG-JL2- als auch die K11-Schwanz-präsentierenden hybriden T7-Bakteriophagenpartikel die Plasmidbibliotheken mindestens so effizient in den Zielbakterienstamm wie die Elektroporation in den Labor-E. coli-Modellstamm (Abb. 1b und Ergänzungstabelle 2). Insbesondere war die maximale Anzahl der an die Wirtsbakterien abgegebenen Plasmide durch Transduktion um mindestens zwei Größenordnungen höher als durch Elektroporation (Erweiterte Daten, Abb. 1a und Ergänzungstabelle 2).

Darüber hinaus zeigt die Langzeitsequenzierung, dass sowohl die durchschnittliche DNA-Fragmentgröße als auch die Fragmentvielfalt der von T7-Phagenpartikeln gelieferten Bibliotheken mit denen der durch Elektroporation in E. coli gelieferten Bibliothek vergleichbar sind (Abb. 1c, d und Ergänzungstabelle). 3). Dies weist darauf hin, dass die Transduktion durch umprogrammierte Bakteriophagenpartikel keinen ernsthaften verzerrenden Effekt auf die Größe und Diversität der gelieferten metagenomischen Bibliotheken hat. Schließlich sequenzierten wir den Plasmidgehalt von 38 isolierten einzelnen Bakterienklonen nach der Phagentransduktion. Erfreulicherweise wurde die Co-Transduktion von zwei Plasmiden in dieselbe Zelle, ein Phänomen, das bei einer Screening-Kampagne zu falsch positiven Anhaltertreffern führt, nur in 5 % der Zellen nachgewiesen, während die Co-Transduktion von zwei Plasmiden in dieselbe Zelle durch Elektroporation erfolgte trat in 10 % der Zellen auf (Extended Data Abb. 1b). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass bestimmte T7-transduzierende Bakteriophagenpartikel mit ausgetauschten Schwanzfasern geeignete Transportvehikel für die funktionelle Metagenomik sind.

Unser nächstes Ziel bestand darin, unseren Ansatz für die Beteiligung weiterer bakterieller Pathogenspezies zu verallgemeinern. Die Transduktionseffizienzen der meisten Hybridphagenpartikel liegen deutlich unter dem Schwellenwert (>107 Transduktanten pro ml), der für die Lieferung vollständiger funktioneller metagenomischer Bibliotheken in die Zielbakterienzellen erforderlich ist21. Darüber hinaus erfordert die Bereitstellung solcher Bibliotheken die Verwendung hoher Konzentrationen der transduzierenden Phagenpartikel. In solchen Fällen tötet die replikative Phagenkontamination, ein häufiges Problem bei der Erzeugung transduzierender Bakteriophagenpartikel27, einen großen Teil der Zielzellen ab (Extended Data Abb. 1c).

Um diese beiden Probleme zu überwinden, haben wir ein gerichtetes Evolutionsexperiment durchgeführt, um die Schwanzfaserregionen in den T7-Phagenpartikeln genetisch zu verändern. Unser Ziel war es insbesondere, Punktmutationen in den Wirtsbereich-bestimmenden Regionen (HRDRs) der Phagenschwanzfasern auszuwählen, die die Wirtsspezifität verändern28,29. Zu diesem Zweck haben wir zunächst drei Schwanzfasern (Escherichia-Phage T7, Salmonella-Phage ΦSG-JL2 und Salmonella-Phage Vi06) mit besonders breiten Wirtsbereichen ausgewählt21. Anschließend identifizierten wir potenzielle HRDRs im Schwanzfasergen gp17 des Salmonella-Phagen ΦSG-JL2 und vi06_43 des Salmonella-Phagen Vi06. Die Identifizierung basierte auf Sequenzhomologie zu vier HRDRs in der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) des gut charakterisierten T7- und T3-Phagenschwanzfaser-Gens gp17 (Methoden und Ergänzungstabelle 4)28,29. Als nächstes führten wir zufällig verteilte Mutationen innerhalb und in der Nähe der HRDRs von Schwanzfasergenen ein, die von den Phagen ΦSG-JL2, Vi06 und T7 abgeleitet waren, und zwar mithilfe einer ortsgerichteten Hochfrequenz-Mutagenesemethode namens DIvERGE (Abb. 2a und Methoden)22. Im Vergleich zu anderen Mutageneseprotokollen hat DIvERGE den Vorteil, zufällige Mutationen an mehreren DNA-Stellen gleichzeitig einzuführen und kann relativ lange DNA-Segmente abdecken, möglicherweise über die vorhergesagten HRDRs22 hinaus.

a, Schematischer Überblick über das gerichtete Evolutionsexperiment, bestehend aus den folgenden Schritten. (1) Phagenschwanzmutagenese in E. coli mit DIvERGE. DIvERGE ist eine Rekombinationstechnik, die weich-randomisierte einzelsträngige (ss) DNA-Oligonukleotide in mehrere Zielstellen einbaut (Methoden). Phagenschwänze werden auf verpackbaren Plasmiden kodiert. (2) Infektion von E. coli mit T7, dem die Schwanzgene fehlen (T7Δ(gp11-12-17)). Dieser Schritt erzeugt mutierte Phagenpartikel, die jeweils das zugehörige mutierte Phagenschwanz-kodierende Plasmid enthalten. (3) Auswahl von Phagenschwanzvarianten, die DNA mit verbesserter Effizienz in die ausgewählten Zielzellen (1–3) injizieren. Der Selektionsdruck wird durch ein Antibiotikum ausgeübt, gegen das auf dem Plasmid ein Antibiotika-Selektionsmarker kodiert ist. b, Transduktionseffizienzen (tfu ml−1) der effizientesten mutierten Schwanzfasern im Vergleich zu den WT-Schwänzen der Eltern. Die Zielzellen sind Enterobacter cloacae ATCC 23355, Shigella sonnei HNCMB 25021 und E. coli NCTC 13351 sowie der phagenresistente E. coli-Modellstamm (BW25113ΔtrxAΔwaaR). Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3 biologisch unabhängige Experimente). Die Daten sind in der Ergänzungstabelle 4 verfügbar.

Unter Verwendung eines Transduktionsoptimierungsprotokolls21 wählten wir als Nächstes Phagenschwanzvarianten mit einer verbesserten Fähigkeit zur Abgabe von Plasmidbibliotheken an Vertreter von drei pathogenen Bakterienarten aus: Enterobacter cloacae ATCC 23355, Shigella sonnei HNCMB 25021 und E. coli NCTC 13351 (Methoden, Abb. 2b und). Ergänzungstabelle 4). Gleichzeitig wählten wir als Positivkontrolle die T7-Phagenschwanzbibliothek mit demselben Protokoll in Gegenwart eines phagenresistenten E. coli-Modellstamms (BW25113ΔtrxAΔwaaR) mit defizienten in die Zellwand eingebetteten Lipopolysaccharidrezeptoren von T7-ähnlichen Phagen30,31 aus.

Als Ergebnis der gerichteten Evolution wurde die DNA-Transduktionseffizienz bei allen drei getesteten pathogenen Bakterienstämmen um ein bis sieben Größenordnungen verbessert (Abb. 2b). Mit Shigella sonnei HNCMB 25021 erreichte die Transduktionseffizienz das Niveau, das für die Bereitstellung ganzer metagenomischer Plasmidbibliotheken geeignet ist (Abb. 2b). Im Fall des Positivkontroll-Modellstamms ΔwaaR tragen die effizientesten mutierten T7-gp17-HRDRs spezifische Kombinationen von Mutationen, von denen 28 % zuvor als adaptive Mutationen beschrieben wurden (Extended Data Abb. 2a – c). Insgesamt erhöhten die adaptiven Mutationen die Transduktionseffizienz (Abb. 2b, erweiterte Daten Abb. 2d und Ergänzungstabelle 4) und minimierten sie zumindest in einem Fall (T7 gp17V544G (Mut1 in Abb. 2b) mit Shigella sonnei HNCMB 25021) auch replikative Phagenkontamination (eine Erklärung finden Sie in den erweiterten Daten in Abb. 3 und in der Ergänzungstabelle 5). Erfreulicherweise führte die Transduktion der drei metagenomischen Bibliotheken in Shigella sonnei HNCMB 25021 durch diese T7-Phagenschwanzvariante zu funktionellen metagenomischen Bibliotheken, die ebenso groß und vielfältig sind wie die durch Elektroporation im E. coli-K12-Stamm erhaltene Bibliothek (Extended Data Abb. 4). und Ergänzungstabellen 2 und 3). Insgesamt fanden wir heraus, dass die gerichtete Evolution des Phagenschwanzes die Bereitstellung metagenomischer Bibliotheken in bisher unerschlossene Bakterienstämme im Vergleich zur Bereitstellung derselben Bibliotheken durch Elektroporation verbessert.

Unser nächstes Ziel bestand darin, die Probenahme des bakteriellen Antibiotika-Resistoms durch funktionelle Metagenomik in mehreren Bakterienwirten zu verbessern. Zu diesem Zweck haben wir die oben beschriebenen drei metagenomischen Bibliotheken (Boden, Darm, klinisch) in drei pathogenen Bakterienwirten (Salmonella enterica LT2, K. pneumoniae NCTC 9131 und Shigella sonnei HNCMB 25021) und in E. coli BW25113 gescreent. Die Screenings wurden auf festem Agar in Gegenwart eines von 13 ausgewählten Antibiotika durchgeführt, die fünf Hauptantibiotikaklassen abdecken (erweiterte Datentabelle 1), und zwar in Konzentrationen, bei denen die Wildtyp-Wirtsstämme (WT) anfällig sind. Die Liste umfasst sechs Antibiotika (Doxycyclin (DOX), Gentamicin (GEN), Cefdinir (CFD), Cefoxitin (CEF), Meropenem (MER) und Moxifloxacin (MOX)) mit langer klinischer Vorgeschichte („alt“) und sieben weitere ( Eravacyclin (ERA), Omadacyclin (OMA), Apramycinsulfat (APS), Ceftobiprol (CEF), Sulopenem (SUL), Delafloxacin (DEL) und Gepotidacin (GEP)), die kürzlich (nach 2017) in die Klinik eingeführt wurden oder werden derzeit in der klinischen Entwicklung („aktuell“, Stand April 2020, erweiterte Datentabelle 1). Alle untersuchten Antibiotika, einschließlich CEF32, zeigten Wirksamkeit gegen gramnegative Krankheitserreger. Bemerkenswert ist, dass APS seit über einem Jahrzehnt in der Veterinärmedizin eingesetzt wird, sich jedoch derzeit in der klinischen Prüfung zur Behandlung systemischer gramnegativer Infektionen beim Menschen befindet33.

Die erhaltenen Resistenz verleihenden Plasmide wurden gepoolt und mit einer modifizierten Dual-Barcode-Shotgun-Expressionsbibliothek-Sequenzierungspipeline sequenziert (Extended Data Abb. 5 und Methoden; siehe auch Lit. 34). Das Protokoll vermeidet die PCR-Amplifikation von Resistenz verleihenden DNA-Fragmenten und bewahrt so die ursprüngliche Zusammensetzung der Proben. Durch den Abgleich der erhaltenen DNA-Sequenzen mit Antibiotikaresistenzgenen in relevanten Datenbanken35,36 stellten wir fest, dass 84 % der 571 Fragmente eine ausreichende Sequenzähnlichkeit (Methoden) mit bekannten Resistenzgenen aufwiesen (Ergänzungstabelle 6). Da viele der erkannten ARGs auf mehreren verschiedenen DNA-Fragmenten isoliert wurden, wurden ARGs mit einer Identität und Abdeckung von 95 % geclustert, um die Sequenzredundanz im Datensatz zu reduzieren37. Um die Reproduzierbarkeit der Pipeline zu quantifizieren, wiederholten wir das vollständige Protokoll (eine Bibliothekslieferung, Screening und Sequenzierung) mit K. pneumoniae. Erfreulicherweise wurden 83,3 % der ARGs in beiden biologischen Replikaten isoliert (Abb. 3a).

a, Reproduzierbarkeit der Pipeline. Das Venn-Diagramm zeigt die Anzahl der ARGs, die in zwei biologischen Replikat-Screens mit K. pneumoniae nachgewiesen wurden. Der Schnittpunkt stellt die in beiden Replikaten isolierten ARGs dar, was einer Reproduzierbarkeit von 83 % entspricht (Ergänzungstabelle 6). b, Venn-Diagramm, das die Anzahl isolierter ARGs unter Verwendung von E. coli und den übrigen Wirtsspezies zeigt. Bei Verwendung von E. coli als alleinigem Wirt blieben 43 % der insgesamt 114 ARGs unentdeckt (Ergänzungstabelle 6). c, Wärmekarte, die die Genfamilien der ARGs zeigt, die anhand der vier Wirtsspezies identifiziert wurden. Der Farbcode quantifiziert die Anzahl der identifizierten ARGs, die zur Genfamilie gehören (Ergänzungstabelle 7). d, Anzahl der in den vier Wirten identifizierten ARGs in den drei verwendeten Resistomen (Ergänzungstabelle 6). e, Anzahl der mobilen (als HGT dargestellt, um den Nachweis einer Beteiligung am horizontalen Gentransfer anzuzeigen) und nicht mobilen (als Nicht-HGT dargestellt, um die fehlende Beteiligung am horizontalen Gentransfer anzuzeigen) ARGs, die auf mehreren und einzelnen Contigs im vorhanden sind metagenomische Bibliotheken (zweiseitiger exakter Fisher-Test, P = 1,058 × 10−5, n = 114; Ergänzungstabelle 6).

Insgesamt wurden 114 ARGs nachgewiesen, von denen viele in mehreren DNA-Fragmenten vorhanden waren (Ergänzungstabellen 6 und 7). Die Analyse ergab auch erhebliche Unterschiede in den identifizierten ARG-Repertoires zwischen den vier untersuchten Wirtsbakterienarten. Insbesondere wenn die Analyse auf E. coli als Bakterienwirt beschränkt wurde, blieben 43 % der insgesamt 114 ARGs unentdeckt (Abb. 3b – d und erweiterte Daten, Abb. 6). Dies weist darauf hin, dass DEEPMINE durch die Nutzung mehrerer Wirtsbakterien eine umfassendere Probenahme der bakteriellen Resistome ermöglicht. Effluxpumpen, ihre entsprechenden Transkriptionsregulatoren und Antibiotika-inaktivierenden Enzyme waren unter den nachgewiesenen ARGs häufig (Abb. 3c und erweiterte Daten Abb. 7a). Ein erheblicher Teil der aus Darm, Boden und klinischen Mikrobiomen isolierten ARGs stammte von Proteobakterien, die in unseren Screenings phylogenetisch nahe Verwandte der Wirtsbakterienspezies sind (Extended Data Abb. 7b).

Anschließend haben wir festgestellt, ob die in unserem Screening erkannten ARGs in der Natur anfällig für horizontalen Gentransfer sind. ARGs, die in der Vergangenheit in mit Menschen in Verbindung stehenden Umgebungen mobilisiert wurden, stellen möglicherweise ein höheres Gesundheitsrisiko dar, da sie möglicherweise unter menschlichen Krankheitserregern weit verbreitet sind38. Um dieses Problem zu untersuchen, haben wir einen mobilen Genkatalog erstellt, der auf der Identifizierung nahezu identischer Gene basiert, die von entfernt verwandten Bakteriengenomen gemeinsam sind37,39,40. Konkret führten wir die paarweise Ausrichtung von 2.794 Genomen phylogenetisch unterschiedlicher, mit dem Menschen verwandter Bakterienarten durch (Ergänzungstabelle 8). Dieser Datensatz wurde um eine Sequenzdatenbank von 27.939 natürlichen Plasmiden erweitert, die aus verschiedenen Umgebungen stammen (Ref. 41, Methoden). Von Plasmiden getragene ARGs wurden besonders wahrscheinlich zwischen Bakterienarten übertragen, wobei die beiden Datensätze zu mobilen ARGs zu 91 % übereinstimmten (Ergänzungstabelle 7). Bemerkenswerterweise waren in unserem Screening in mehreren DNA-Fragmenten vorhandene ARGs in der Natur häufiger einem horizontalen Gentransfer ausgesetzt als ARGs, die nur in einem einzelnen DNA-Fragment vorhanden waren (Abb. 3e).

Als nächstes fragten wir, wie die Variation in den nachgewiesenen ARG-Repertoires zwischen den vier Bakterienwirten erklärt werden kann. Die erste Hypothese war, dass bestimmte ARGs aufgrund des stochastischen Plasmidverlusts unentdeckt bleiben. Dies kann während der Transduktion der metagenomischen Bibliothek in ihre neuen Wirte oder während des Screening-Prozesses geschehen. Alternativ sind die übertragenen ARGs möglicherweise nicht funktionell mit der Physiologie aller Bakterienwirte kompatibel20. Daher sorgen einige ARGs nur bei bestimmten Bakterienarten für Resistenz. Während die erste Hypothese sicherlich relevant ist, deuten mehrere Beweislinien auf erhebliche Unterschiede im Resistenzphänotyp von ARGs zwischen verschiedenen Bakterienarten hin.

Um diese Hypothesen zu testen, untersuchten wir zunächst, wie DNA-Fragmente, die bei E. coli für Antibiotikaresistenz sorgen, die Antibiotika-Anfälligkeit bei den anderen drei Wirtsbakterienarten beeinflussen. Wir analysierten einen repräsentativen Satz von 13 Resistenz verleihenden DNA-Fragmenten, die aus unseren Screenings stammten, indem wir den Grad der Antibiotikaresistenz maßen, die sie in den Bakterienwirten hervorrufen. Da bestimmte ARGs in mehreren Antibiotika-Screenings nachgewiesen wurden, haben wir insgesamt 20 Antibiotika-DNA-Fragment-Kombinationen untersucht (Abb. 4a). In sieben der 20 untersuchten Fälle führte das DNA-Fragment bei mindestens einer der drei anderen Bakterienarten zu keinen Veränderungen im Resistenzniveau (wobei eine zweifache Änderung der minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) als Grenzwert verwendet wurde). Daher überlappten im Durchschnitt nur 80 % der funktionellen ARGs zwischen den Paaren von E. coli und den anderen drei Arten. Darüber hinaus beobachteten wir eine erhebliche, bis zu 256-fache Variation des Resistenzniveaus, das durch die spezifischen DNA-Fragmente bereitgestellt wird (Abb. 4a und Ergänzungstabelle 9). Effluxpumpen, Transkriptionsregulationsproteine und antibiotikamodifizierende Enzyme zeigten bei den untersuchten Bakterienarten gleichermaßen große Unterschiede in den Resistenzniveaus (Abb. 4a).

a, Wärmekarte, die erhebliche Unterschiede in den Resistenzniveaus zeigt, die durch die 13 Resistenz verleihenden DNA-Fragmente in den vier Wirtsarten bereitgestellt werden. Der Farbcode quantifiziert MIC-Fold-Änderungen. Weiße Farbe bedeutet keine Änderung des Widerstandsniveaus, wobei eine zweifache Änderung des MHK als Grenzwert verwendet wird. Die Daten sind in der Ergänzungstabelle 9 verfügbar. b, Angepasste Jaccard-Ähnlichkeitskoeffizienten, die die Überlappungen funktioneller ARG-Sätze zwischen Paaren von Wirtsarten nach Kontrolle des Messrauschens darstellen (siehe Methoden und erweiterte Daten, Abb. 8). Die Zahlen in Klammern stellen 95 %-Konfidenzintervalle dar (Methoden).

Abschließend haben wir alle in den metagenomischen Screenings entdeckten Resistenz verleihenden DNA-Fragmente erneut untersucht. Wir haben die entsprechenden Plasmide gepoolt und die resultierende vorselektierte Plasmidbibliothek erneut in jede der vier nativen Bakterienwirtsarten eingeführt. Anschließend führten wir mit dieser Bibliothek auf festem Agar neue Antibiotika-Selektionsscreens durch, wie zuvor beschrieben. Um den stochastischen Plasmidverlust während der Transduktion zu kontrollieren, sequenzierten wir die neue Plasmidbibliothek vor und nach der Antibiotikaselektion. Von den ARGs wurden 70 % (80 von 114) nach der Transduktion, aber vor der Antibiotikaauswahl durch mindestens ein Plasmid in allen vier bakteriellen Wirtsarten repräsentiert (Ergänzungstabelle 10). Nach der Antibiotikaauswahl wurde festgestellt, dass 63 dieser ARGs bei mindestens einer der vier bakteriellen Wirtsspezies eine antibakterielle Aktivität zeigten (Ergänzungstabelle 10). Bemerkenswerterweise wurden 16 der 17 ARGs, die während der Antibiotikaauswahl verloren gingen, nur von einem einzigen Resistenz verleihenden DNA-Fragment kodiert (Extended Data, Abb. 8a). Nach Anpassung der Überlappungen an die Genauigkeit des Bildschirms (Extended Data Abb. 8b) überlappten im Durchschnitt 70 % der ARGs zwischen Artenpaaren (Abb. 4b und Extended Data Abb. 8c). Insgesamt zeigten nur ~46 % der ARGs (~29 von 63) Resistenz bei allen vier Bakterienwirtsspezies (Extended Data Abb. 8d). Zukünftige Arbeiten an größeren metagenomischen Datensätzen sollten eindeutig die genauen biochemischen, zellulären und phylogenetischen Merkmale aufdecken, die die Artenspezifitätsprofile von ARGs prägen.

Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass ARGs bei der Übertragung auf neue Bakterienwirte häufig artspezifische Auswirkungen auf die Antibiotikaempfindlichkeit haben.

Als nächstes haben wir abgeschätzt, wie anfällig die „neuen“ Antibiotika im Vergleich zu den „alten“ Antibiotika für die ARG-Mobilisierung sind. Wir fanden heraus, dass die Gesamtzahl der ARGs für die beiden Antibiotikagruppen statistisch gleich ist (Abb. 5a, Tabelle 1), unabhängig von den berücksichtigten Mikrobiomen (Erweiterte Daten, Abb. 9a). Darüber hinaus blieben die obigen Ergebnisse erhalten, wenn die Analyse auf ARGs mit etablierten horizontalen Gentransferereignissen beschränkt wurde (Abb. 5b und erweiterte Daten, Abb. 9b). Wie erwartet überschneiden sich die Resistenzmechanismen weitgehend zwischen „alten“ und „neuen“ Antibiotika, die derselben Wirkstoffklasse angehören (Abb. 5c), was darauf hindeutet, dass Kreuzresistenzen vorherrschen könnten. CEF, ein Cephalosporin der fünften Generation, das kürzlich für die Behandlung von im Krankenhaus und ambulant erworbener Lungenentzündung zugelassen wurde42,43 unterstreicht diesen Punkt. Sowohl die Gesamthäufigkeit von ARGs (z. B. β-Lactamasen) als auch die Häufigkeit mobiler ARGs waren im Vergleich zu CEF außergewöhnlich hoch (Tabelle 1), selbst im Vergleich zu denen „alter“ β-Lactam-Antibiotika mit jahrzehntelanger klinischer Anwendung (Abb . 5a–c). Tatsächlich hydrolysieren β-Lactamasen mit erweitertem Spektrum (ESBLs) im Allgemeinen Ceftobiprol44, weshalb sein klinischer Nutzen gegen gramnegative multiresistente Krankheitserreger, die solche ESBLs produzieren, begrenzt ist45.

a: Die Gesamtzahl der ARGs ist statistisch gesehen für „neue“ und „alte“ Antibiotika gleich (zweiseitiger Wilcoxon-Rangsummentest, P = 0,8051, n = 107 für „alt“ und n = 114 für „neu“; Ergänzungstabelle 7). b, Das Gleiche gilt für ARGs mit etablierten horizontalen Gentransferereignissen (P = 0,6106, zweiseitiger Wilcoxon-Rangsummentest, n = 27 und 23 für „alte“ bzw. „neue“ Antibiotika; Ergänzungstabelle 7). c) Resistenzmechanismen überschneiden sich weitgehend zwischen „alten“ und „neuen“ Antibiotika, die derselben Wirkstoffklasse angehören. Die Heatmap zeigt die Clusterung der Antibiotika basierend auf den ARG-Profilen. Die Farbcodierung quantifiziert die Anzahl der erkannten ARGs, die nach Mechanismus gruppiert sind. Die Daten sind in der Ergänzungstabelle 7 verfügbar.

Eine bemerkenswerte Ausnahme von diesem Trend ist APS, ein Antibiotikum in der klinischen Prüfung zur Anwendung beim Menschen. Gegen dieses Antibiotikum wurde im Darmresistom nur ein einziges ARG nachgewiesen und in der gepoolten Sammlung klinischer Isolate keines (Ergänzungstabelle 7). In Übereinstimmung mit der jahrzehntelangen umfassenden Verwendung von APS in der Veterinärmedizin wurden jedoch im Bodenmikrobiom mehrere ARGs gegen APS nachgewiesen (Abb. 5c). Bei den identifizierten ARGs handelt es sich größtenteils um Aminoglycosid-Acetyltransferasen, die in mehreren pathogenen Wirten funktionell kompatibel sind (Tabelle 1, Ergänzungstabelle 7 und Abb. 5c). Dies deutet darauf hin, dass diese Gene in Zukunft ein potenzielles klinisches Risiko darstellen könnten. In Übereinstimmung mit dieser Erwartung wurde eine dieser Aminoglycosid-Acetyltransferasen, AAC(3)-IV, bereits in APS-resistenten klinischen Bakterien nachgewiesen46. Insgesamt könnte DEEPMINE ein nützliches Werkzeug zur Vorhersage von ARGs sein, die derzeit nur in nicht-menschlichen Mikrobiomen nachweisbar sind und potenzielle Auswirkungen auf die Gesundheit haben.

In dieser Arbeit stellen wir DEEPMINE vor, einen Ansatz, der das Spektrum der in der funktionellen Metagenomik anwendbaren Wirtsbakterienarten erweitert. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass das Wirtsspektrum von Bakteriophagen durch den Austausch der Schwanzfaser des E. coli-Phagen T7 oder durch die Erzeugung zufälliger Mutationen in den für die T7-Schwanzfaser kodierenden Genen erweitert werden kann21. DEEPMINE verwendet solche umprogrammierten Bakteriophagen-transduzierenden Partikel mit ausgetauschten und/oder mutagenisierten Schwanzfasern, um große metagenomische Plasmidbibliotheken in eine Reihe von Bakterienarten einzuschleusen (Abb. 1). Der Hauptvorteil von DEEPMINE gegenüber bestehenden Techniken zur funktionellen Metagenomik, wie Elektroporation oder Konjugation, ist seine höhere Effizienz. Insbesondere fanden wir heraus, dass DEEPMINE besser für die Einführung metagenomischer Plasmidbibliotheken mit kleinen Inserts (1,5 kb–5 kb) in die ausgewählten Bakterienwirte geeignet ist als die Elektroporation (Abb. 1 und Extended Data Abb. 1)4,47. Während die Konjugation häufig verwendet wird, um Bibliotheken mit großen Insertgrößen (10 kb–40 kb) bereitzustellen, die typischerweise 104–105 Klone enthalten, ist es sehr schwierig, mit dieser Technik mehr als 106–107 Transkonjuganten zu erhalten48,49. Andererseits erfordert eine metagenomische Bibliothek mit kleinem Insert (1,5 kb–5 kb), wie sie in dieser Studie verwendet wird, normalerweise mehr als >108 Plasmide, um Bibliotheken mit ausreichender Abdeckung bereitzustellen.

Mit unserem Ansatz führten wir 156 Metagenomik-Screenings mit allen möglichen Kombinationen von 13 Antibiotika, drei Metagenomik-Bibliotheken (isoliert aus Boden-, Darm- und klinischen Mikrobiomen) und vier verwandten Enterobacteriaceae-Arten durch. Wir zeigen, dass durch die Untersuchung mehrerer Wirtsarten das bakterielle Resistom erheblich erweitert wird; 43 % der nicht überlappenden ARGs blieben unentdeckt, wenn nur eine einzige Art (E. coli) berücksichtigt wurde (Abb. 3). Dementsprechend ermöglicht DEEPMINE die Identifizierung von ARGs, die nur gegen bestimmte klinisch relevante Krankheitserreger resistent sind. Tatsächlich haben wir eine große Anzahl von ARGs gegen kürzlich entwickelte Antibiotika identifiziert, die möglicherweise zukünftige Gesundheitsrisiken darstellen (Abb. 5). Auf der Grundlage dieser Ergebnisse gehen wir davon aus, dass DEEPMINE ein nützliches Instrument sein wird, um die zukünftige Verbreitung von ARGs vorherzusagen, für die ein wachsendes allgemeines Interesse besteht6,16,37,38,50. Die derzeitige Einschränkung von DEEPMINE besteht jedoch darin, dass es viel Zeit und Ressourcen erfordert, geeignete Phagenpartikel zu konstruieren, damit die interessierenden Wirtsbakterien für die funktionelle Metagenomik verwendet werden können.

Zusammenfassend bietet unsere Arbeit einen tieferen Einblick in die Kräfte, die das mobile Resistom formen. Zukünftige Arbeiten sollten die beteiligten metagenomischen Bibliotheken erweitern, um die Mobilität und funktionelle Kompatibilität der erkannten ARGs umfassender zu klassifizieren und in einem breiteren Spektrum klinischer Isolate zu testen.

Diese Forschung entspricht allen relevanten ethischen Vorschriften, die vom Human Investigation Review Board des Albert Szent-Györgyi Clinical Center der Universität Szeged und der National Biodiversity Authority (NBA) Indiens genehmigt wurden. Die Genehmigung für die Sammlung von Stuhlproben wurde vom Human Investigation Review Board des Albert Szent-Györgyi Clinical Centre der Universität Szeged (registriert unter 72/2019-SZTE) eingeholt. Die freiwilligen Teilnehmer wurden nach strengen Kriterien ausgewählt: (1) Sie haben vor der Probenspende mindestens ein Jahr lang keine Antibiotika eingenommen und (2) sie sind in einem guten Gesundheitszustand. Diese Anforderungen sind auf diesem Gebiet Standard und gewährleisten einen verzerrungsfreien Vergleich der Antibiotika-Resistome im gesunden menschlichen Darmmikrobiom. Von allen Teilnehmern wurde eine Einverständniserklärung eingeholt. Die Sammlung von Boden- und Flusssedimentproben aus der Umgebung der Städte Hyderabad und Lucknow wurde von der National Biodiversity Authority (NBA), Indien, genehmigt (Antragsnummer: NBA/Tech Appl/9/1822/17/18-19/3535). Zur Vorabbestimmung der Stichprobengrößen wurden keine statistischen Methoden verwendet, aber unsere Stichprobengrößen ähneln denen in früheren Veröffentlichungen18,51,52. Die Proben wurden keinen Versuchsgruppen zugeordnet. Die Proben für jedes einzelne Experiment wurden von einer verantwortlichen Person bearbeitet. Die Datenerfassung und -analyse erfolgte nicht blind gegenüber den Versuchsbedingungen. Es wurden keine Daten von der Analyse ausgeschlossen. Sofern nicht anders angegeben, haben wir uns bei der Verwendung eines Kits an die Anweisungen des Herstellers gehalten.

Aus Gründen der Kompatibilität mit der T7-Transduktion und den Sequenzierungspipelines wurde aus dem pZE21-Expressionsvektor (Ergänzungstabelle 11) ein benutzerdefiniertes Plasmid erstellt. Insbesondere wurde der Replikationsursprung von ColE1 auf p15A umgestellt und das Verpackungssignal des T7-Bakteriophagen eingeführt (verwendete Enzyme und Primer sind in der Ergänzungstabelle 11 aufgeführt). Anschließend wurde der pZE21_p15A-Vektor durch PCR unter Verwendung einer Primermischung mit 10 nt langen Zufallsbarcodes (Ergänzungstabelle 11) amplifiziert, gefolgt von Verdauung und Selbstligation.

Für die Darmmikrobiom-Bibliothek haben wir Stuhlproben von 10 nicht verwandten, gesunden Personen gesammelt, die im Jahr vor der Probenspende keine Antibiotika eingenommen hatten. Für das anthropogene Bodenmikrobiom wurden Proben aus stark mit Antibiotika kontaminierten Industriegebieten in Indien gesammelt53. Metagenomische DNA aus den Darm- und Bodenproben wurde mit dem DNeasy PowerSoil Kit (Qiagen, 47016) extrahiert. Genomische DNA klinischer Bakterienisolate (Ergänzungstabelle 1) wurde unter Verwendung des Sigma GenElute-Bakterien-Genom-DNA-Kits (Sigma, NA2110-1KT) isoliert.

Von jeder Probe wurden 40 µg extrahierte DNA mit dem MluCI-Enzym (NEB, R0538L) verdaut (10 Min., 37 °C) und anschließend inaktiviert (20 Min., 85 °C). Die Menge des MluCI-Enzyms wurde variiert, um DNA im Zielgrößenbereich von 1–5 kbp zu erhalten. Die DNA wurde mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese (Sage Science, PB02901) mit einer 0,75 %igen Agarosegelkassette und einer Niederspannungs-1–6-kbp-Marker-S1-Kassettendefinition isoliert. Die metagenomischen DNA-Fragmente wurden in das pZE21_p15A-Plasmid an der EcoRI-Stelle unter Verwendung eines Massenverhältnisses von Insert:Vektor von 3:1 ligiert. Die reine Ligationsmischung wurde in 40 µl E. coli MegaX (Invitrogen, C640003) oder E. coli 10G ELITE (Lucigen, 60080-2) Zellen elektroporiert. Nach einer Stunde Inkubation bei 37 °C wurden die Transformanten zur Bestimmung der koloniebildenden Einheiten auf 50 µg ml-1 Kanamycin enthaltende Luria Bertani (LB)-Agarplatten in 101-fachen, 102-fachen und 103-fachen Verdünnungen ausplattiert. Der Rest der gewonnenen Zellen wurde über Nacht auf mit Kanamycin ergänzten LB-Agarplatten gezüchtet. Am nächsten Tag wurden Plasmide isoliert. Die Größenverteilung der Inserts wurde durch PCR-Amplifikation relevanter Plasmidregionen von 10–20 zufällig ausgewählten Klonen geschätzt. Die durchschnittliche Insertgröße wurde mit 2–3 kbp ermittelt.

Das transduzierende Hybrid-Bakteriophagenpräparat wurde von Lit. angepasst. 21. Kurz gesagt, E. coli BW25113-Zellen, die Phagenschwanz-kodierende Plasmide enthielten (Ergänzungstabelle 11), wurden auf eine optische Dichte (OD) von 600 nm ~ 0,7 (250 U/min bei 37 °C) gezüchtet und dann 15 Minuten lang auf Eis gelegt. Als nächstes wurden die Kulturen zentrifugiert (2.200 × g, 4 °C, 10 min), der Überstand wurde verworfen und die Zellen in der gleichen Menge Medium (LB oder Terrific Broth (TB)) resuspendiert. Anschließend wurden T7-Bakteriophagen ohne T7-Faser-kodierende Regionen (T7∆(gp11-12-17)) verwendet, um Zellen mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 2–3 zu infizieren. Nach 2-stündiger Inkubation (100 U/min, 37 °C) wurden die Zellen mit 2 % Chloroform behandelt und verwirbelt. Anschließend wurde die Mischung mit den gleichen Parametern wie oben zentrifugiert. Schließlich wurde der Überstand, der Phagenpartikel enthielt, gesammelt.

Die Transduktionseffizienzen wurden wie zuvor beschrieben gemessen21. Kurz gesagt, die Zielbakterienzellen wurden auf OD600 ~0,5 (250 U/min bei 37 °C) gezüchtet, gefolgt von einer 15-minütigen Inkubation auf Eis, bei der Verdünnungen der transduzierenden Phagenpartikel mit zehnfachen Verdünnungsschritten hergestellt wurden. Anschließend wurden 50 µl Zielzellen mit 50 µl Phagenpartikeln aus jeder Verdünnung gemischt. Die Platten wurden 1 Stunde lang bei 37 °C und 180 U/min inkubiert. Anschließend wurden die Proben auf mit Antibiotika versehene Agarplatten getupft. Transduktantbildende Einheiten pro ml (tfu ml−1) wurden auf der Grundlage der Koloniezahlen berechnet.

Der Stamm E. coli K12 BW25113, der Phagenschwanz-kodierende Plasmide enthielt, wurde mit 30 ng jeder Plasmidbibliothek in fünf Parallelen elektroporiert, um geeignete Koloniezahlen zu erreichen, dann auf antibiotikahaltigen LB-Agarplatten ausplattiert und über Nacht wachsen gelassen. Nach dem Wachstum wurden die Zellen in 20 % Glycerin bei –80 °C gelagert. Als nächstes wurden gefrorene Zellen, die die Bibliothek enthielten, in 40 ml LB, ergänzt mit Kanamycin 50 und Streptomycin 100, durch Schütteln bei 230 U/min bei 37 °C gezüchtet, bis eine OD600 von 0,7 erreicht wurde. Die Zellen wurden auf Eis abgekühlt, bei 2.000 × g (4 °C, 10 min) zentrifugiert und in LB-Medium resuspendiert. Anschließend wurde der Bakteriophage T7∆(gp11-12-17) verwendet, um Zellen bei MOI 2–3 zu infizieren. Nach 2-stündiger Inkubation (100 U/min bei 37 °C) wurden die Zellen mit 2 % Chloroform behandelt und verwirbelt. Anschließend wurde die Mischung zentrifugiert und der Überstand gesammelt.

Übernachtkulturen der entsprechenden Bakterienstämme wurden in 50 ml LB-Medium auf eine OD600 von 0,1 verdünnt, um bei 230 U/min und 37 °C bis zu einer OD600 von 0,5 zu wachsen. Als nächstes fügten wir den Zellen 20 ml der Bibliothek mit transduzierenden Partikeln hinzu, gefolgt von einer einstündigen Inkubation bei denselben Parametern. Anschließend wurden die Zellen 10 Minuten lang bei 4 ° C und 2.200 × g zentrifugiert, in 1–5 ml LB-Medium resuspendiert, auf LB + Kanamycin 50 ausplattiert und über Nacht gezüchtet. Am nächsten Tag wurden die Zellen gesammelt und mit Glycerin bei –80 °C gelagert. Von jeder Bibliothek wurden 50 ng in fünf Parallelen in E. coli K12 BW25113 elektroporiert. Die Zellen wurden eine Stunde lang bei 37 °C in SOC-Medium gewonnen, auf LB + Kanamycin50-Platten ausplattiert und über Nacht gezüchtet. Am nächsten Tag wurden die Zellen gesammelt und in 20 % Glycerin bei –80 °C gelagert.

Um die HRDRs der Schwanzfasergene zu lokalisieren, verwendeten wir eine paarweise Sequenzausrichtung, bei der die kürzlich identifizierten HRDRs von gp17 des T3-Coliphagen29 mit den Schwanzfasersequenzen des Escherichia-Phagen T7 gp17, des Salmonella-Phagen ΦSG-JL2 gp17 und des Salmonella-Phagen Vi06 gp43 abgeglichen wurden . Die ermittelten Stellen und die proximalen Regionen wurden dann einer gezielten Mutagenese durch DIvERGE22 unterzogen, einer Technik, die auf dem gezielten Einbau von mutationslasttragenden 90-mer-Oligos basiert. Kurz gesagt, E. coli BW25113-Zellen, die das zu mutierende Phagenschwanz-kodierende Plasmid und das die Mutagenese vermittelnde Plasmid22 trugen, wurden in TB (250 U/min bei 37 °C) unter Zugabe geeigneter Antibiotika auf ~OD600 0,3–0,4 gezüchtet. Als nächstes wurde m-Toluylsäure zugegeben (1 mM Endkonzentration), um die Genexpression zu induzieren, und nach einer Stunde Inkubation wurden die Zellen für 15 Minuten auf Eis übertragen. Die Zellkultur wurde durch wiederholtes Waschen und Zentrifugieren (2.200 × g, 4 ° C, 10 Minuten, dreimal) elektrokompetent gemacht und anschließend mit 2, 5 µM Oligos elektroporiert (Ergänzungstabelle 11). Nach der Erholung in TB (250 U/min, 37 °C, eine Stunde) wurden die Zellen in 19 ml TB mit geeigneten Antibiotika überführt und über Nacht wachsen gelassen. Der Mutagenesezyklus wurde wiederholt, wenn es für notwendig erachtet wurde.

Um Schwanzmutanten mit verbesserter Lieferkapazität auszuwählen, haben wir ein Transduktionsoptimierungsprotokoll angewendet. Kurz gesagt, wir haben drei pathogene Bakterienstämme (Enterobacter cloacae ATCC 23355, Shigella sonnei HNCMB 25021 und E. coli NCTC 13351) basierend auf der anfänglich schwachen Infektiosität des T7-Bakteriophagen ausgewählt. Diese Zielbakterienzellen wurden in LB auf ~OD600 0,5 (250 U/min bei 37 °C) gezüchtet, die Zellen wurden 15 Minuten lang auf Eis gelegt, mit 2 ml Phagenpartikeln im Volumenverhältnis 1:1 gemischt und bei 37 °C inkubiert C und 100 U/min für eine Stunde. Die Mischung wurde dann ausplattiert und bei 37 °C zum Wachsen über Nacht gehalten. Das gleiche Protokoll wurde mit nicht mutagenisierten Wildtyp-Phagenschwanz-tragenden Partikeln durchgeführt. Am nächsten Tag wurden die Kolonien gepoolt und die Plasmid-DNA mit dem GeneJET-Plasmid-Miniprep-Kit (Thermo Fisher) isoliert und dann mit DNA Clean und Concentrator-5 (Zymo Research-Kit, D4004) weiter gereinigt. Von den Plasmiden wurden 100 ng in E. coli BW25113-Zellen elektroporiert. Nach der Genesung wurden die Zellen mit geeigneten Antibiotika versorgt, nach einer Stunde Inkubation auf Agarplatten ausgebreitet und über Nacht wachsen gelassen. Am folgenden Tag wurden die Zellen in 4 ml LB gepoolt, 250 µl wurden in 40 ml TB mit geeigneten Antibiotika überführt und auf ~OD600 0,7 (250 U/min bei 37 °C) gezüchtet. Nach dem Wachstum wurden die Zellen 15 Minuten lang auf Eis gelegt, zentrifugiert (2.200 × g, 4 ° C, 10 Minuten) und resuspendiert. Als nächstes wurden Zellkulturen mit T7∆(gp11-12-17)-Bakteriophagen infiziert. Nach zwei Stunden (100 U/min bei 37 °C) wurden die Zellen mit 2 % Chloroform behandelt und verwirbelt. Nach Zentrifugation bei den oben genannten Parametern wurden die im Überstand vorhandenen Phagen gesammelt. Die Transduktion des untersuchten Bakterienstamms wurde wiederholt, bis eine Sättigung der Anzahl der transduzierten Zellen (~zwei oder drei Runden) zu beobachten war. Schließlich wurden Plasmide einzelner Kolonien sequenziert, um Schwanzmutationen aufzudecken.

E. coli-Zellen, die die Plasmide MGP4240 oder MGP4240_gp17V544G und pZE21_p15A enthielten, wurden mit dem Phagen T7Δ(gp11-12-17) infiziert, um das Plasmid pZE21_p15A zu verpacken. Die resultierenden Phagenpartikel wurden zur Erzeugung von Phagenlysaten in E. coli BW25113 und S. sonnei HNCMB 25021 verwendet, die entweder MGP4240 oder MGP4240_gp17V544G enthielten. Das Vorhandensein der Phagenschwanz-kodierenden Plasmide in den Zielzellen war für die replikative Phagenkontamination zur Bildung von Plaques erforderlich. Für die Plaque-Assays wurden 4 ml Top-Agar hergestellt und mit 100 µg ml−1 Streptomycin (Sigma, S6501-25G) und 400 µl der Übernachtkulturen ergänzt. Schließlich wurden von jedem Phagenstamm 10 µl in 1–1010-fachen Verdünnungen auf den oberen Agar getropft.

Für die Bereitstellung einer funktionellen metagenomischen Bibliothek wurde die in der T7-gp17V544G-Phagenschwanzvariante identifizierte Mutation in das Plasmid MGP424021 eingeführt, indem eine vollständige Plasmidamplifikation mit Primern verwendet wurde, die die entsprechende Mutation trugen, gefolgt von einer DpnI-Behandlung (Thermo Fisher, ER1701), um die ursprüngliche, methylierte Matrize zu eliminieren Plasmid-DNA und anschließende Gelelektrophorese, Gelextraktion und Selbstligation. Die Plasmide wurden dann in E. coli BW25113-Zellen elektroporiert. Transformanten, die die gewünschten Konstrukte trugen, wurden durch PCR identifiziert und durch Sequenzierung validiert.

Funktionelle Selektionen auf Resistenz wurden auf Agarplatten mit Mueller-Hinton-Bouillon (Sigma, 90922) durchgeführt, die einen Konzentrationsgradienten eines bestimmten Antibiotikums enthielten (angepasst aus Lit. 54). Antibiotika wurden von Sigma oder MedChem Express gekauft. Die Anzahl der ausplattierten Zellen deckte mindestens das Zehnfache der Größe der entsprechenden metagenomischen Bibliothek ab. Die Platten wurden 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Für jede funktionelle Selektion wurde eine Kontrollplatte mit der gleichen Anzahl von Zellen hergestellt, die das leere Plasmid (d. h. das Plasmid ohne kloniertes DNA-Fragment an der Mehrfachklonierungsstelle) enthielten, das die Hemmzone der antimikrobiellen Verbindung für die Zellen ohne zeigte irgendein Resistenzplasmid. Die resistenten Klone aus den Bibliotheken wurden durch gemeinsames Waschen der sporadischen Kolonien aus dem Plattenbereich (distal zur Hemmzone und mit höherer Antibiotikakonzentration) isoliert, der durch visuelle Inspektion im Vergleich zur Hemmzone der Kontrollplatte definiert wurde. Die Hälfte der in LB suspendierten Kultur wurde zur Plasmidisolierung verwendet (GeneJET-Plasmid-Miniprep-Kit; Thermo Fisher, PLN70-1KT), der Rest wurde mit Glycerin eingefroren und bei –80 °C gelagert.

Die erhaltenen Resistenz verleihenden Plasmide wurden mit einer Hybrid-Sequenzierungspipeline (Extended Data Abb. 5) basierend auf Ref. sequenziert. 34. Long-Read-Sequenzierung identifiziert die metagenomischen DNA-Fragmente (Inserts) und die beiden 10 nt langen zufälligen Barcodes, die vor- und nachgelagert (Uptag bzw. Downtag) jedes metagenomischen DNA-Fragments vorkloniert wurden. Aliquots von Plasmid-DNA-Präparaten, die bei jedem Screening erhalten wurden, wurden in einem äquimolaren Verhältnis gepoolt. Genomische DNA-Kontaminationen wurden durch Doppelverdauung mit Lambda-Exonuklease und Exonuklease-I aus der Mischung entfernt. Die resultierende Probe wurde gereinigt (DNA Clean and Concentrator-5, Zymo Research Kit) und quantifiziert. Als nächstes wurde die Plasmidmischung durch Zugabe von 5 U SrfI-Restriktionsendonuklease (NEB, R0629S) pro 1 µg Plasmid-DNA linearisiert (eine Stunde bei 37 °C, gefolgt von einer 20-minütigen Inaktivierung bei 65 °C), und die DNA wurde linearisiert quantifiziert mit dem Qubit dsDNA-Breitband-Assay-Kit (Thermo Fisher, Q33266), bevor es auf die Long-Read-Sequenzierung von Oxford Nanopore angewendet wird. Auf jedes funktionelle metagenomische Plasmid-DNA-Präparat (vorheriges Pooling) wurde eine parallele Multiplex-Short-Read-Deep-Sequenzierung angewendet, um Nanoporen-Contigs mit Screening-Proben zu verknüpfen (Extended Data, Abb. 5). Zu diesem Zweck haben wir die Up- und Downtag-Barcodes auf den Plasmidpräparaten jedes Selektionsexperiments separat verstärkt, indem wir Illumina-spezifische Vorwärts- und Rückwärts-Primerpaare verwendet haben. Jedes Primerpaar enthielt P5- bzw. P7-Adaptersequenzen und 8 nt lange Barcodes für Multiplexing- und Plasmid-Annealing-Stellen (Ergänzungstabelle 11). Wir führten eine PCR mit Phusion High-Fidelity-DNA-Polymerase (Thermo Fisher, F530S) unter Verwendung der folgenden Reaktionsmischung durch: 15 ng Template-Plasmid-DNA, 4 µl 5× GC-Puffer, 0,2 µl Phusion High-Fidelity-DNA-Polymerase, 0,6 µl DMSO (Dimethyl). Sulfoxid), 0,2 mM dNTPs, 0,5–0,5 µM Vorwärts- und Rückwärtsprimer und Wasser in einem Endvolumen von 20 µl. Die folgenden Thermocycler-Bedingungen wurden verwendet: 95 °C für fünf Minuten, 30 Zyklen von 95 °C für 30 Sekunden + 59 °C für 30 Sekunden + 72 °C für 5 Sekunden, 72 °C für sieben Minuten. Nach der Konzentrationsmessung jeder PCR-Reaktion haben wir die Proben im Massenverhältnis 1:1 gemischt. Als nächstes isolierten wir die 137 bp lange Fragmentmischung aus 0,75 % Agarosegel.

Bibliotheken wurden unter Verwendung eines Ligationssequenzierungskits (Oxford Nanopore Technologies, SQK-LSK109) mit 1 µg Plasmid-DNA vorbereitet. Die DNA wurde mit dem NEBNext FFPE Repair (M6630S) und dem Ultra II End Prep Kit (E7546S) endpräpariert, mit Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63882) gereinigt und dann der Adapter mit NEBNext Quick T4 DNA Ligase (E6056S) ligiert. Schließlich wurde die angepasste Bibliothek mit Agencourt AMPure gereinigt, mit Qubit 3.0 quantifiziert, mit ONT-Laufpuffer und Ladekügelchen gemischt, mit einer an ein MinION-Gerät angeschlossenen FLO-MIN106 9.4.1 SpotON-Durchflusszelle vorbereitet und 72 Stunden lang laufen gelassen. Für das Basecalling wurde der Guppy-Algorithmus (v8.25) mit hochpräzisen Konfigurationseinstellungen verwendet. Rohdaten wurden mithilfe von NanoFilt v2.7.155 nach Qualitätswert (QC ≥ 7) und Länge (4.000–8.000 bp) gefiltert. Lesevorgänge wurden mit minimap2 (v2.17)56 auf die Referenzsequenz abgebildet; SAM-Dateien wurden in sortierte BAMs konvertiert; Die Einfügungssequenzen wurden extrahiert und Barcodes wurden identifiziert und zu den Lese-/Einfügungsnamen hinzugefügt, indem der Unterbefehl „samtools tview (1.11-9-ga53817f)“57 verwendet wurde. einzelne FASTQ-Dateien wurden mit SEQTK (v0.13.2)58 erstellt; Konsensussequenzen wurden mit SPOA (v4.0.2)59 mit den folgenden Parametern generiert: -l 0 -r 0 -g -2. Schließlich wurden die rohen Konsenseinfügungen unter Verwendung des relevanten Satzes von Einfügungssequenzen von minimap2 und racon (v1.4.19)56 poliert, um die endgültigen Konsenseinfügungen mit mindestens 100-facher Abdeckung zu erstellen. Die Längen und Diversitäten der gelieferten metagenomischen DNA-Fragmente wurden mithilfe von Long-Read-Deep-Sequencing direkt nach der Elektroporation in E. coli BW25113 und der Transduktion in Salmonella enterica subsp. bestimmt. enterica Serovar Typhimurium str. LT2, K. pneumoniae NCTC 9131 und S. sonnei HNCMB 25021. Shannon-Alpha-Diversitätsindizes (H) wurden auf der Grundlage der Häufigkeit jedes einzelnen Contigs aller Wirte unter Verwendung des veganen R-Pakets (2,5–7)60 berechnet.

Gepoolte Sequenzierungsbibliotheken wurden mit 0,1 M NaOH denaturiert, mit HT1-Hybridisierungspuffer (Illumina) auf 12 pM verdünnt und mit 40 % PhiX Control v3 (Illumina) Sequenzierungskontrollbibliothek gemischt. Denaturierte Sequenzierungspools wurden auf das MiSeq-Reagenzienkit V2-300 (Illumina) geladen und 2 × 70-bp-Sequenzablesungen wurden mit einem Illumina-MiSeq-Instrument mit benutzerdefinierten Sequenzierungsprimern für Read 1, Read 2 und Index 1 generiert, die in den entsprechenden Kartuschenpositionen (12, 14 bzw. 13) bei einer Endkonzentration von 0,5 µM.

Resistente Plasmidpools, die aus dem metagenomischen Screening gesammelt wurden, wurden gemischt und in die vier Wirte erneut transformiert oder erneut elektroporiert. Selektionsexperimente wurden auf Gradienten-Agarplatten wie zuvor beschrieben durchgeführt (siehe oben „Funktionelle Selektion von Antibiotikaresistenzen“). Resistente Kolonien wurden gesammelt und nach der Plasmidvorbereitung wurden die Barcodes auf den Plasmiden durch Illumina-Sequenzierung (ergänzende Methoden) sequenziert. Um die Überlappungen zwischen funktionellen ARG-Sätzen verschiedener Arten zu berechnen, haben wir zunächst die Genauigkeit des Screenings geschätzt, indem wir die Ergebnisse mit denen der MIC-Messungen der 13 ausgewählten Resistenz verleihenden DNA-Fragmente verglichen haben. Auf der Grundlage dieser Vergleiche haben wir die Richtigkeits-Positiv-, Falsch-Positiv-, Richtig-Negativ- und Falsch-Negativ-Rate des Bildschirms geschätzt. Als nächstes haben wir für jedes Artenpaar einen angepassten Jaccard-Index berechnet, der die Genauigkeit des Bildschirms wie folgt berücksichtigt. Für jede Art haben wir den ursprünglichen Vektor der Anwesenheit/Abwesenheit erkannter Resistenzinstanzen durch einen neuen Vektor ersetzt, bei dem die ursprünglichen Anwesenheits- (Abwesenheits-)Werte zufällig mit einer Wahrscheinlichkeit beibehalten wurden, die dem positiven (negativen) Vorhersagewert (d. h. dem Anteil) entspricht der wirklich positiven Ergebnisse unter allen positiven Fällen und der Anteil der wirklich negativen Ergebnisse unter allen negativen Fällen). Das Verfahren wurde 50.000 Mal wiederholt und die Mediane und 95 %-Konfidenzintervalle der Jaccard-Indizes zwischen Artenpaaren berechnet.

Wir haben gemessen, wie DNA-Fragmente, die E. coli eine Antibiotikaresistenz verleihen, die Anfälligkeit bei Shigella sonnei HNCMB 25021, K. pneumoniae NCTC 9131 und Salmonella enterica subsp. beeinflussen. enterica Serovar Typhimurium str. LT2. Zu diesem Zweck verwendeten wir einen repräsentativen Satz von 13 Plasmiden, die in unseren Antibiotika-Selektionsscreens isoliert wurden. Für jeden Stamm wurden die bereitgestellten Resistenzniveaus (d. h. die MHK) mit einer standardmäßigen 12-stufigen Mikroverdünnungsmethode in 96-Well-Platten gemessen und die MIC-Fachänderung durch Vergleich mit der MHK des entsprechenden leeren Vektorträgers bestimmt Kontrollstämme. Die MHK-Werte wurden anhand des Zellwachstums (OD600) nach 24-stündiger Inkubation (37 °C, 180 U/min) bestimmt.

Jede Konsens-Insert-Sequenz aus der Nanoporen-Sequenzierung wurde mit Screening-Proben (Wirt, Resistom, Antibiotikum) verknüpft, indem die Nanopore- und Illumina-Datensätze über die einzigartigen Uptag- und Downtag-Barcodes mit einem benutzerdefinierten R-Skript kombiniert wurden. Um ARGs in den metagenomischen Contigs zu identifizieren, wurden zwei parallele Ansätze verwendet: (1) Open Reading Frame (ORF)-Vorhersage mit Prodigal 61, gefolgt von Annotation mit BLASTP-Suche in CARD35- und ResFinder36-Datenbanken, mit einer Abdeckung von >50 bp bei e-value < 10−5 und (2) BLASTX-Suche mit denselben Parametern, jedoch ohne ORF-Vorhersage, um das Risiko abgeschnittener ORFs aufgrund von Frame-Shifting-Sequenzierungsfehlern zu verringern. Um Low-Fidelity-Sequenzierungsdaten aus dem Datensatz zu entfernen, wurden metagenomische DNA-Fragmente herausgefiltert, die durch <10 Konsensus-Insert-Sequenzen im Nanoporen-Datensatz und <9 Reads im Illumina-Uptag- und Downtag-Barcode-Datensatz unterstützt wurden.

Wenn ein metagenomisches DNA-Fragment mehr als ein vorhergesagtes ARG enthielt, wurden ARGs herausgefiltert, von denen bekannt ist, dass sie auf eine andere Antibiotikaklasse (basierend auf CARD- und ResFinder-Referenzdatenbanken) als die, die wir im Auswahlexperiment verwendet haben, wirken. ARG-Sequenzen mit einer Identität und Abdeckung von mindestens 95 % auf DNA-Sequenzebene wurden zu ARG-Clustern zusammengefasst37. Jeder Cluster wurde durch den Treffer dargestellt, der den bekannten ARGs in den Datenbanken Card35 und ResFinder36 am nächsten kam (Ergänzungstabelle 6). Spenderorganismen, von denen die zusammengesetzten DNA-Contig-Sequenzen stammten, wurden durch eine Nukleotidsequenz-Ähnlichkeitssuche identifiziert, wobei die DNA-Contigs als Abfrage anhand der NCBI Reference Prokaryotic Database (RefProk, heruntergeladen am 21. März 2021) mit einem Schwellen-E-Wert von 10–10 verwendet wurden. Die taxonomische Hierarchie (Königreich, Stamm, Klasse, Ordnung, Familie, Gattung, Art) wurde mithilfe des Taxonomizr-Pakets in R (v0.8.0) erfasst.

Um den mobilen Genkatalog zu erstellen (d. h. eine Datenbank kürzlich übertragener DNA-Sequenzen zwischen Bakterienarten40), haben wir wie zuvor 1.377 Genome verschiedener mit dem Menschen verwandter Bakterienarten aus der Datenbank „Integrated Microbial Genomes and Microbiomes“ heruntergeladen40 und 1.417 Genome von Gram- negative ESKAPE-Erreger aus der NCBI RefSeq-Datenbank (Ergänzungstabelle 8). Mit NCBI Blastn 2.10.1+62 haben wir die Nukleotidsequenzen durchsucht, die zwischen Genomen verschiedener Arten geteilt werden. Die Parameter zum Filtern der NCBI-Blastn-2.10.1+-Blast-Ergebnisse waren die folgenden: Mindestprozentsatz der Identität, 99 %; Mindestausrichtungslänge: 500; maximale Ausrichtungslänge: 20.000. Die Blast-Hits wurden nach cd-hit-est 4.8.163,64 gruppiert, mit einem Sequenzidentitätsschwellenwert von 99 %. Wir haben die ORFs für die Explosionstreffer mit Prodigal v2.6.361 vorhergesagt und nur diejenigen beibehalten, die länger als 500 nt sind. Um den mobilen Genkatalog zu erstellen, haben wir sie dann mit den zusammengeführten Datenbanken CARD 3.1.035 und ResFinder (d48a0fe)36 unter Verwendung von Diamond v2.0.4.14265 verglichen. Schließlich wurden natürliche Plasmidsequenzen identifiziert, indem 27.939 vollständige Plasmidsequenzen aus der PLSDB-Datenbank (v2020-11-19)41 heruntergeladen wurden. Anschließend wurden repräsentative Sequenzen der isolierten 114 ARG-Cluster mit BLASTN sowohl im mobilen Genkatalog als auch in natürlichen Plasmidsequenzen mit einer Identitäts- und Abdeckungsschwelle von 90 % durchsucht. ARGs, die im mobilen Genkatalog und/oder in natürlichen Plasmidsequenzen vorhanden waren, wurden als mobil angesehen.

Die statistische Analyse wurde mit R (v4.1.1) durchgeführt. Der parametrische Zwei-Stichproben-t-Test wurde verwendet, um die Unterschiede zwischen den Mittelwerten der Stichprobengruppen zu bewerten. Der exakte Fisher-Test wurde verwendet, um signifikante Zusammenhänge zwischen zwei Variablen zu bestimmen. Der Shannon Alpha Diversity Index wurde verwendet, um die Diversität der DNA-Contigs in den Bibliotheken unter Verwendung des Vegan-Pakets (v2.5–7) in R66 zu charakterisieren. Es wurde davon ausgegangen, dass die Datenverteilung normal sei, dies wurde jedoch nicht offiziell getestet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Illumina-Reads und Nanopore-Contigs für diese Studie wurden im European Nucleotide Archive (ENA) am EMBL-EBI unter der Zugangsnummer PRJEB54063 (https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB54063) hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Skripte und andere Dateien, die zur Reproduktion der Analyse benötigt werden, sind unter https://github.com/stitam/Apjok-et-al-DEEPMINE-NatMicrobiol verfügbar.

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Wir danken D. Verma von der Abteilung für Mikrobiologie und B. Bhimrao von der Ambedkar University, Lucknow, Indien, für ihre Hilfe bei der Sammlung von Bodenproben und der NBA-Genehmigung. Diese Arbeit wurde durch die National Laboratory of Biotechnology Grants NKFIH-871-3/2020 und 2022-2.1.1-NL-2022-00008 (BK und CP) unterstützt; Das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union gemäß der Finanzhilfevereinbarung Nr. 739593 (BP und BK); der Europäische Forschungsrat H2020-ERC-2014-CoG 648364-Resistance Evolution (CP) und H2020-ERC-2019-PoC 862077–Aware (CP); Zuschüsse des Nationalen Büros für Forschung, Entwicklung und Innovation FK-135245 (BK) und FK-124254 (OM); das Nationale Büro für Forschung, Entwicklung und Innovation und das Ministerium für Innovation und Technologie im Rahmen des „Frontline“-Programms KKP 129814 und 126506 (BP und CP); das National Laboratory for Health Security RRF-2.3.1-21-2022-00006 (BP), GINOP-2.3.2–15–2016–00014 (EVOMER, CP und BP), GINOP-2.3.2–15–2016– 00020 (MolMedEx TUMORDNS, CP), GINOP-2.3.2-15-2016-00035 (NZ); ein János-Bolyai-Forschungsstipendium der Ungarischen Akademie der Wissenschaften (BO/352/20 (BK), BO/00303/19/8 (OM)); Neues Nationales Exzellenzprogramm des Ministeriums für Humanressourcen (UNKP-20-5-SZTE-654 und UNKP-21-5-SZTE-579, BK); Neues Nationales Exzellenzprogramm des Ministeriums für Innovation und Technologie, finanziert vom Nationalen Forschungs-, Entwicklungs- und Innovationsfonds (ÚNKP-20-3 -SZTE-452, GA); das Doktorandenstipendienprogramm des kooperativen Doktorandenprogramms des Ministeriums für Innovation und Technologie, finanziert durch den Nationalen Forschungs-, Entwicklungs- und Innovationsfonds (KDP-17-4/PALY-2021, C992025, MS). RH, BG, PU und AG wurden von GINOP-2.3.4-15-2020-00010, GINOP-2.3.1-20-2020-00001, BECOMING-2019–1-HU01-KA203–061251, dem Horizont der Europäischen Union, unterstützt Forschungs- und Innovationsprogramm 2020 im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Fördervereinbarung Nr. 754432 und das polnische Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung aus den Finanzmitteln für die Wissenschaft im Zeitraum 2018–2023. Diese Forschungsarbeit wurde mit Unterstützung des National Academy of Scientist Education Program der National Biomedical Foundation unter der Schirmherrschaft des ungarischen Ministeriums für Kultur und Innovation (DK) durchgeführt.

Pramod K. Jangir

Derzeitige Adresse: Department of Zoology, University of Oxford, Oxford, Großbritannien

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Gábor Apjok, Mónika Számel und Chryso Christodoulou.

Abteilung für synthetische und Systembiologie, Institut für Biochemie, Biologisches Forschungszentrum, Nationales Labor für Biotechnologie, Eötvös Loránd Research Network (ELKH), Szeged, Ungarn

Gábor Apjok, Mónika Számel, Chryso Christodoulou, Viktória Seregi, Bálint Márk Vásárhelyi, Tamás Stirling, Bálint Eszenyi, Tóbiás Sári, Fanni Vidovics, Erika Nagrand, Dorina Kovács, Petra Szili, Ildikó Ilona Lantos, Orsolya Méhi, Pramod K. Jangir, Gábor Draskovits, Ákos Nyerges, Gergely Fekete, Balázs Papp, Pál Csaba & Bálint Kintses

Doctoral School of Biology, Universität Szeged, Szeged, Ungarn

Gábor Apjok, Mónika Számel, Tamás Stirling, Tóbiás Sári & Pramod K. Jangir

HCEMM-BRC Forschungsgruppe für translationale Mikrobiologie, Szeged, Ungarn

Viktória Seregi & Bálint Kintses

Institut für Biochemie, Biologisches Forschungszentrum, Nationales Labor für Gesundheitssicherheit, Eötvös Loránd Research Network (ELKH), Szeged, Ungarn

Tamás Stirling & Balázs Papp

Doktoratsschule für multidisziplinäre medizinische Wissenschaften, Universität Szeged, Szeged, Ungarn

Petra Szili

Bioinformatik-Forschungsgruppe, Genomik und Bioinformatik-Kerneinrichtung, Szentágothai-Forschungszentrum, Universität Pécs, Pécs, Ungarn

Róbert Herczeg, Bence Gálik, Péter Urbán und Attila Gyenesei

Abteilung für klinische Molekularbiologie, Medizinische Universität Bialystok, Bialystok, Polen

Bence Gálik & Attila Gyenesei

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, Fakultät für Naturwissenschaften und Informatik, Universität Szeged, Szeged, Ungarn

László Bodai und Bálint Kintses

Abteilung für Genetik, Fakultät für Naturwissenschaften und Informatik, Universität Szeged, Szeged, Ungarn

Nora Zsindely

Direktion für Veterinärdiagnostik, Nationales Büro für Lebensmittelkettensicherheit, Budapest, Ungarn

Denes Béla

Abteilung für klinische Mikrobiologie und Immunologie, Sackler School of Medicine, Universität Tel Aviv, Tel Aviv, Israel

Ido Yosef und Udi Qimron

HCEMM-BRC Metabolic Systems Biology Lab, Szeged, Ungarn

Balázs Papp

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GA und BK haben das Projekt konzipiert. MS, GA, CC, BMV, T.Sári, EN, PKJ, AN, CP und BK planten die Experimente und Datenanalysen. MS, GA, VS, DK, IIL, FV, BE, T.Sári, PS, EN, OM, GD, BD führten die Experimente durch. LB, NZ führte eine Illumina-Sequenzierung durch, RH, BG, PU, AG führten eine Nanopore-Sequenzierung durch. MS, GA, CC, BMV, T.Stirling, GF, RH, BP, CP und BK analysierten die experimentellen Daten und führten bioinformatische Analysen durch. BK, CP, CC, MS und GA haben das Manuskript mit Beiträgen aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Pál Csaba oder Bálint Kintses.

GA, MS, T.Sári, OM, UQ und BK sind Erfinder einer bei DEEPMINE (Europäisches Patentamt) eingereichten Patentanmeldung. Das Biologische Forschungszentrum Szeged besitzt ein aktives Patent auf DIVERGE (PCT/EP2017/082574, US 10.669.537 B2, Europäisches Patent Nr. 3526327), wobei BK und CP Erfinder sind. UQ ist Chief Technology Officer von Trobix Innovation Ltd. und Erfinder einer anhängigen Patentanmeldung für eine Methode zur Erzeugung von Bakteriophagenvarianten mit erweiterten Wirtsbereichen (PCT/IL2017/050734). Alle anderen Autoren haben keine konkurrierenden Interessen.

Nature Microbiology dankt Trevor Charles, Kevin Forsberg und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Vergleich der Elektroporations- und Transduktionseffizienzen. Die Abbildung zeigt, dass die maximale Anzahl der an die Wirte abgegebenen Plasmide bei allen drei pathogenen Wirtsarten durch Transduktion mindestens zwei Größenordnungen höher ist als durch Elektroporation (Mittel- und Fehlerbalken stellen Mittelwert und Standardfehler dar (n = 3 biologisch unabhängige Experimente)) ). Die Daten finden Sie in der Ergänzungstabelle 2. b, PCR-amplifizierte metagenomische Inserts aus transduzierten Zellen. Nach der Transduktion und Elektroporation wurden die metagenomischen DNA-Fragmente mittels PCR unter Verwendung plasmidspezifischer Primer auf beiden Seiten des metagenomischen DNA-Fragments amplifiziert und anschließend durch Kapillarsequenzierung sequenziert. Dieses Experiment unterscheidet monoklonale Zellen (einzelnes PCR-Produkt und DNA-Sequenz) von solchen, die von zwei oder mehr Plasmiden co-transduziert wurden (doppelte Banden auf dem Gel und gemischtes Signal in der Kapillarsequenz). Die PCR wurde bei jedem Wirt-Bibliothek-Paar mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. c) Während der Erzeugung transduzierender Bakteriophagenpartikel bleibt ein großer Teil der Phagen replikativ und tötet die für die Phagenerzeugung verwendeten Bakterienzellen ab. Daher nimmt die Transduktionseffizienz mit zunehmender Phagenkonzentration nicht wie erwartet zu, sondern ab. Die Abbildung zeigt die Transduktionseffizienz des T7-transduzierenden Phagenpartikels, der den T7-Phagenschwanz beherbergt (schwarze Linie), auf Shigella sonnei HNCMB 25021 bei verschiedenen Verdünnungen (siehe Methoden). Die rote gestrichelte Linie zeigt die erwartete Steigerung der Transduktionseffizienz ohne erkennbare Abtötungswirkung replikativer Phagen. Die Daten sind in der Ergänzungstabelle 2 verfügbar.

Quelldaten

a: Die mutierten T7-gp17-HRDRs tragen normalerweise spezifische Kombinationen von Mutationen, von denen 28 % zuvor als adaptive Mutationen beschrieben wurden. Heatmap, die die Anzahl der Fälle darstellt, in denen eine Mutation in den 50 sequenzierten T7-Phagenschwanz-HRDRs auftritt. Adaptive Mutationen nach (Huss et al.28) werden mit einem roten Punkt gekennzeichnet. Die häufige Kombination spezifischer adaptiver Mutationen weist auf das Potenzial von DIvERGE hin, Mutationen, die die Wirtsspezifität verändern, mit hoher Effizienz zu finden. Daten sind in der Ergänzungstabelle 4 verfügbar. b,c, Verteilung der nachgewiesenen Mutationen über die mutagenisierten Phagenschwanzfasergene Escherichia-Phage T7 gp17 und Salmonella-Phage ΦSG-JL2 gp17. Vorhergesagte HRDRs werden über gefärbte Regionen unterschieden, wie in (Yehl et al.29) mit dem T3-Bakteriophagen. d, Transduktionseffizienzen der mutierten Phagenschwänze T7 (grau) und ΦSG-JL2 (gelb) im Vergleich zu ihren Wildtyp-Gegenstücken mit dem LPS-defizienten Stamm E. coli K12 BW25113 ΔtrxAΔwaaR. Die Y-Achse zeigt die Anzahl der transduzierten Zellen in 1 ml. Mittel- und Fehlerbalken stellen Mittelwert und Standardfehler dar (n = 3 biologisch unabhängige Experimente). Beachten Sie, dass wir keinen angereicherten mutierten Salmonella-Phagen Vi06 gp43 beobachtet haben, was darauf hindeutet, dass die Schwanzfaser des Salmonella-Phagen Vi06 an einen anderen Zelloberflächenrezeptor als LPS bindet. Die Daten sind in der Ergänzungstabelle 4 verfügbar.

Quelldaten

a, Schematische Darstellung der Erzeugung transduzierender Phagenpartikel mit T7 gp17WT. Im ersten Schritt des Prozesses infiziert der T7-Bakteriophage, dem die für die Schwanzfaser kodierenden Gene in seinem Genom fehlen, der aber ansonsten die Wildtyp-T7-Schwanzfaser aufweist, die E. coli-BW25113-Zelle, die das metagenomische Plasmid und ein Phagenschwanz-exprimierendes Plasmid trägt. Die Infektion führt zur Produktion von Phagenpartikeln, die laut Yosef et al. entweder das metagenomische Plasmid (transduzierendes Phagenpartikel) oder das Phagengenom (replikativer Phagen) tragen. Wenn der Phagenschwanz, der vom Phagenschwanz-exprimierenden Plasmid kodiert wird (und daher auf den erzeugten T7-Partikeln angezeigt wird), E. coli effizient infizieren kann, akkumuliert die replikative Phagenkontinuität während des Prozesses, da das Phagengenom, das die Phagenpartikel enthält, eine neue Reproduktion einleiten kann Zyklus. b, Die Anzahl der metagenomischen Plasmide, die in Shigella sonnei HNCMB 25021 durch die T7-Phagenpartikel abgegeben werden, die die Schwanzfasern gp17WT (blau) oder gp17V544G (grün) beherbergen (einseitiger t-Test mit zwei Proben, P = 0,01944. Mitte und Fehler Balken stellen Mittelwert und Standardfehler dar, n = 3 biologisch unabhängige Experimente). Die Daten finden Sie in der Ergänzungstabelle 5. c, Replikative Phagenkontamination, gemessen durch Plaquebildung der T7-transduzierenden Phagenpartikel, die die Schwanzfasern gp17WT (blau) oder gp17V544G (grün) beherbergen (siehe Methoden). Der Plaque-Assay wurde sowohl mit E. coli BW25113 als auch mit S. sonnei HNCMB 25021 durchgeführt (zweiseitiger t-Test bei zwei Stichproben, P = 0,000168 und P = 0,013476 bei Anwendung mit E. coli bzw. S. sonnei. Mitte). und Fehlerbalken stellen Mittelwert und Standardfehler dar; n = 3 biologisch unabhängige Experimente). Die Daten finden Sie in der Ergänzungstabelle 5. d, Replikative Phagenkontamination, gemessen durch transduzierte S. sonnei HNCMB 25021-Koloniezahlen mit T7-Phagenpartikeln, die die Schwanzfasern gp17WT (blau) oder gp17V544G (grün) beherbergen. Eine geringere Menge replikativer Phagen in der T7-gp17V544G-transduzierenden Partikelprobe wird durch die zunehmende Koloniezahl selbst bei hohen Konzentrationen des transduzierenden Partikels angezeigt. Bemerkenswerterweise wird im Gegensatz zu der ergänzenden Abbildung 5c in diesem Experiment die replikative Phagenaktivität bei der höchsten Konzentration des transduzierenden Partikels nachgewiesen. (n = 2 biologische Replikate. Mittel- und Fehlerbalken stellen Mittelwert und Standardfehler dar.) Daten verfügbar in Ergänzungstabelle 5. e, Transduktionseffizienzen der T7-Phagenpartikel, die gp17WT- (blau) oder gp17V544G-Schwanzfasern (grün) in E. coli beherbergen BW25113 (zweiseitiger t-Test bei zwei Stichproben, P = 0,00553, n = 3 biologisch unabhängige Experimente. Mittel- und Fehlerbalken stellen Mittelwert und Standardfehler dar). Die Daten sind in der Ergänzungstabelle 5 verfügbar. f, Schematische Darstellung des angenommenen Schemas zur Erzeugung transduzierender Phagenpartikel mit T7 gp17V544G. Die verringerte Transduktionseffizienz für E. coli BW25113 verhindert die Reproduktion des replikativen Phagen nach dem ersten Infektionszyklus. Beachten Sie, dass der erste Infektionszyklus vom T7 gp17WT durchgeführt wird. Zusammenfassend führt die ineffiziente Infektion von E. coli durch den mutierten Phagenschwanz zu einer geringeren Menge replikativer Phagen.

Quelldaten

a: Die Abgabe der funktionellen metagenomischen Plasmidbibliothek ist durch T7 gp17V544G-Bakteriophagenpartikel in Shigella sonnei HNCMB 25021 genauso effizient wie durch Elektroporation in E. coli BW25113 (P = 0,19769, einseitiger t-Test mit zwei Stichproben, n = 3 biologisch unabhängige Experimente). Mittel- und Fehlerbalken stellen den Mittelwert und den Standardfehler dar.) Die Daten sind in der Ergänzungstabelle 2 verfügbar. b,c, Längen bzw. Diversitäten der gelieferten metagenomischen DNA-Fragmente, bestimmt durch Verwendung von Long-Read-Deep-Sequenzierung direkt nach Elektroporation und Transduktion (Methoden). Gestrichelte Linien stellen die durchschnittliche Größe der DNA-Fragmente dar. Shannon-Alpha-Diversitätsindizes (H) wurden basierend auf der Häufigkeit von Fragmenten mit identischen Sequenzen in den Bibliotheken berechnet (n = 276899, n = 162107, für E. coli bzw. S. sonnei). Die Daten sind in der Ergänzungstabelle 3 verfügbar.

Quelldaten

Die Pipeline ähnelt einem zuvor veröffentlichten Arbeitsablauf (Dual Barcoded Shotgun Expression Library Sequencing Pipeline (Mutalik et al.34)) mit einer Modifikation, die die PCR-Amplifikation von Resistenz verleihenden metagenomischen DNA-Fragmenten vermeidet und daher die ursprüngliche Zusammensetzung der Proben bewahrt (Methoden). ). Der Workflow besteht aus den folgenden Schritten. Zunächst wurden alle aus den Screenings erhaltenen funktionellen metagenomischen Plasmide gepoolt und dann unter Verwendung der SrfI-Restriktionsendonuklease linearisiert. SrfI verfügt über eine acht Basenpaare lange Erkennungssequenz, um die Verdauung des metagenomischen Inserts zu minimieren. Die linearisierten Plasmide werden dann einer Nanopore-Long-Read-Sequenzierung (Methoden) unterzogen. Die Long-Read-Sequenzierung identifiziert das metagenomische DNA-Fragment (Insert) und die beiden 10 Nukleotide langen Zufallsbarcodes, die stromaufwärts und stromabwärts (Uptag bzw. Downtag) jedes metagenomischen DNA-Fragments vorkloniert wurden (Methoden). Parallel dazu wurde vor dem Zusammenfassen der metagenomischen Plasmide aus jedem Screen eine Multiplex-Short-Read-Deep-Sequenzierung angewendet, um die plasmidkodierten eindeutigen Barcodes auf jeder Seite der metagenomischen Fragmente in jedem funktionellen metagenomischen Screen auszulesen. Insbesondere wurden die Uptag- und Downtag-Sequenzen mit barcodierten Illumina-Sequenzierungskompatiblen Primern (BC) PCR-amplifiziert. Nach der Illumina-Sequenzierung und Demultiplexierung der Proben mithilfe der BC-Barcodes werden die Nanopore- und Illumina-Datensätze kombiniert, um jedes Plasmid (identifiziert durch die Up- und Downtags) einer Screening-Charge zuzuordnen, die eine einzigartige Kombination aus Wirt, Antibiotikum und Bibliothek darstellt.

a, Prozentsatz der ARGs, die in jedem der vier Wirte eindeutig (blau) und in Überlappung mit mindestens einem weiteren Wirt (rot) identifiziert wurden. E. coli identifizierte nur 57 % der 114 ARGs. b: Im Durchschnitt überlappen nur 44 % (gekennzeichnet durch eine horizontale gestrichelte Linie) der erkannten ARGs zwischen Artenpaaren, nachdem die Variabilität der Replikatbildschirme (83 %) berücksichtigt wurde, d. h. die prozentuale Überlappung zwischen Artenpaaren durch geteilt die prozentuale Überlappung zwischen Replikationsbildschirmen (0,365/0,83). Die Daten sind in der Quelldatendatei 6 verfügbar. Boxplots zeigen den Median (mittlere horizontale Linie), das erste und dritte Quartil (unten bzw. oben in der Box), wobei Whiskers entweder den maximalen (minimalen) Wert oder das 1,5-fache des Interquartilbereichs von anzeigen die Daten; n = 80 für E. coli, n = 101 für K. pneumoniae, n = 56 für S. enterica und n = 37 für S. sonnei, wobei „n“ die Anzahl der im jeweiligen Wirt identifizierten ARGs ist. Die Daten finden Sie in der Ergänzungstabelle 6.

a, Die Abbildung zeigt die Anzahl der ARGs, die aus verschiedenen phylogenetischen Gruppen stammen, und die Verteilung jeder Gruppe auf Wirte und Resistome (n = 114). Der Großteil der ARGs stammt von Proteobakterien. Daten verfügbar in Quelldatendatei 7. b, Die Abbildung zeigt die Anzahl der in den verschiedenen mechanistischen Kategorien identifizierten ARGs und die funktionale Kompatibilität jeder Kategorie mit mehreren Wirten (n = 114). Die häufigsten Kategorien waren Antibiotika-Inaktivierung, Antibiotika-Efflux und Regulatoren des Antibiotika-Efflux. Die Daten finden Sie in der Ergänzungstabelle 7.

a: Ein deutlich höherer Anteil an ARGs, die bei keiner Art einen Resistenzphänotyp liefern konnten, war auf einem einzelnen Resistenz verleihenden DNA-Fragment vorhanden, im Vergleich zu ARGs, die bei mindestens einer Art (Zweischwänziger Fischerfisch) nachgewiesen wurden und einen Resistenzphänotyp lieferten exakter Test, P = 0,032, n = 80, Ergänzungstabelle 10). b, Geschätzte Genauigkeit des Bildschirms basierend auf der Verwendung der MIC-Messungen als Goldstandard-Datensatz. Beachten Sie, dass wir ein ARG (QnrB73) aus den MIC-Messungen ausgeschlossen haben, da die Wiedereinführung dieses ARG in jede der vier Wirtsbakterienspezies nicht durch Sequenzierung der Plasmidbibliothek bestätigt wurde (Quelldatendatei 9). Das Vorhandensein einer Resistenz im MHK-Datensatz wurde als eine mehr als zweifache Änderung des relativen MHK-Werts definiert. Falsch negative Treffer sind jene ARGs, die im Screening nicht erkannt wurden, aber in den MIC-Messungen einen Resistenzphänotyp zeigten. Falsch positive Treffer sind solche, die in den MHK-Messungen keine Resistenz lieferten, im Screening jedoch einen Resistenzphänotyp erkennen ließen. Wir gingen davon aus, dass Plasmid-Trampen eine Hauptquelle für falsch positive Ergebnisse ist. Die Daten sind in der Ergänzungstabelle 9c verfügbar: Die Verteilung der angepassten Jaccard-Ähnlichkeitskoeffizienten, die die Überlappungen funktioneller ARG-Sätze zwischen Paaren von Wirtsarten darstellen, nachdem die Messgenauigkeit mithilfe eines stochastischen Ansatzes kontrolliert wurde (Methoden). Die gestrichelte Linie, die blaue Linie und die rote Linie stellen den gemessenen Jaccard-Ähnlichkeitskoeffizienten für Wirtsartenpaare, den Median der angepassten Jaccard-Ähnlichkeitskoeffizienten und die Unter- bzw. Obergrenze der 95 %-Konfidenzintervalle dar. d, Insgesamt wird geschätzt, dass nur ca. 46 % der ARGs (ca. 29 von 63) Resistenz bei allen vier bakteriellen Wirtsarten bieten. Das Histogramm zeigt die Anzahl der ARGs, die schätzungsweise bei allen vier Wirtsspezies Resistenz verleihen, wenn die Falsch-Positiv- und Falsch-Negativ-Raten des Screenings unter Verwendung eines stochastischen Ansatzes berücksichtigt werden (siehe Methoden). Die gestrichelte Linie, die blaue Linie und die rote Linie stellen den gemessenen Jaccard-Ähnlichkeitskoeffizienten für Wirtsartenpaare, den Median der angepassten Jaccard-Ähnlichkeitskoeffizienten und die Unter- bzw. Obergrenze der 95 %-Konfidenzintervalle dar. (siehe Methoden).

a: Die Gesamtzahl der ARGs ist statistisch gesehen für die alten und neuen Antibiotikagruppen gleich, unabhängig davon, welche Mikrobiome berücksichtigt wurden. (anthropogener Boden: P = 0,4377, anthropogener Boden (Darm/klinisch): P = 0,601, Welch Two-Sample zweiseitiger t-Test, n = 5 und n = 5 für neu und alt, wobei „n“ für die steht Anzahl der Antibiotika; Boxplots zeigen den Median (mittlere horizontale Linie), das erste und dritte Quartil (unten bzw. oben in der Box), wobei Whiskers entweder den maximalen (minimalen) Wert oder das 1,5-fache des Interquartilbereichs der Daten anzeigen ). b, Die obigen Ergebnisse blieben erhalten, als die Analyse auf ARGs mit etablierten horizontalen Gentransferereignissen beschränkt wurde (anthropogener Boden: P = 0,1994, zweiseitiger Welch Two-Sample t-Test, n = 3 und n = 2 für neu und alt, wobei „n“ jeweils die Anzahl der Antibiotika darstellt; humanassoziiert (Darm/klinisch): P = 0,6426, Welch Two-Sample t-Test, n = 4 und n = 5, für neu bzw. alt). Die Daten finden Sie in der Ergänzungstabelle 7.

Ergänzende Methoden, Beschreibung der erweiterten Datentabelle 1, ergänzende Tabellen 1–11 und Quelldaten, erweiterte Datenabbildungen. 1–4.

Ergänzende Tabellen 1–11.

Unbeschnittener Scan des Gelbilds in Extended Data Abb. 1 (Klebsiella pneumoniae NCTC 9131 + Bodenbibliothek durch K11-Phage).

Unbeschnittener Scan des Gelbilds in Extended Data Abb. 2 (Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Typhimurium str. LT2 + Gut-Bibliothek durch ΦSG-JL2-Phage).

Unbeschnittener Scan des Gelbilds in Extended Data Abb. 3 (Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Typhimurium str. LT2 + klinische Bibliothek des ΦSG-JL2-Phagen).

Unbeschnittener Scan des Gelbildes in Extended Data Abb. 4 (Elektroporation in Escherichia coli K12 BW25113).

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Nachdrucke und Genehmigungen

Apjok, G., Számel, M., Christodoulou, C. et al. Charakterisierung von Antibiotika-Resistomen durch umprogrammierte, durch Bakteriophagen ermöglichte funktionelle Metagenomik in klinischen Stämmen. Nat Microbiol 8, 410–423 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01320-2

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Eingegangen: 26. November 2021

Angenommen: 04. Januar 2023

Veröffentlicht: 09. Februar 2023

Ausgabedatum: März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01320-2

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Charakterisierung von Antibiotika-Resistomen durch umprogrammierte Bakteriophagen