Aktivierung des basalen Vorderhirns

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 22044 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Umwelteinflüsse und innere Zustände wie Stimmung, Belohnung oder Abneigung beeinflussen das Fressverhalten direkt über die homöostatische Notwendigkeit hinaus. Der Hypothalamus wurde ausführlich auf seine Rolle bei der homöostatischen Ernährung untersucht. Viele der neuronalen Schaltkreise, die eine komplexere, nicht homöostatische Ernährung steuern, die Valenz- und Sinnesreize (wie Geschmack und Geruch) integrieren, sind jedoch noch unbekannt. Hier beschreiben wir einen Schaltkreis vom basalen Vorderhirn (BF) zur lateralen Habenula (LHb), der das nichthomöostatische Fütterungsverhalten direkt moduliert. Mithilfe viral vermittelter Schaltkreiskartierung haben wir eine Population glutamaterger Neuronen innerhalb des BF identifiziert, die auf das LHb projizieren, das auf verschiedene sensorische Signale reagiert, einschließlich aversiver und lebensmittelbedingter Gerüche. Die optogenetische Aktivierung der BF-zu-LHb-Schaltkreise führt zu einer starken, reflexartigen Abneigung. Darüber hinaus unterdrückt die Aktivierung dieser Schaltung den Drang, im nüchternen Zustand zu essen. Zusammengenommen zeigen diese Daten eine Rolle basaler glutamaterger Neuronen im Vorderhirn bei der Modulation der LHb-assoziierten Abneigung und des Fressverhaltens durch Wahrnehmung von Umweltreizen.

Beim Füttern handelt es sich um ein Appetitverhalten, das für das Überleben aller Tiere unerlässlich ist. Bei der homöostatischen Ernährung oder Fütterung zur Deckung des Kalorienbedarfs wird die Kalorienabgabe mit der Kalorienaufnahme in Einklang gebracht, um das richtige Gewicht und die Stoffwechselgesundheit aufrechtzuerhalten. Dies ist jedoch nur eine Komponente des Fressverhaltens. Umwelteinflüsse (wie Geschmack und Geruch), Stimmung, Belohnung und Abneigung wirken sich alle auf die Nahrungsaufnahme aus und können dazu führen, dass die Nahrungsaufnahme über oder unter dem normalen gesunden Kalorienbedarf liegt1,2,3. Im Gegensatz zur homöostatischen Ernährung haben sich diese nicht-homöostatischen Ernährungsmechanismen entwickelt, um Organismen an eine sich verändernde Umgebung anzupassen, in der Nahrungsquellen möglicherweise unzuverlässig sind. Wenn Nahrung jedoch leicht zugänglich ist, können diese Mechanismen schlecht angepasst werden.

Ein klassisches Beispiel für nichthomöostatische Fütterung ist belohnungsbasiertes hedonisches Verhalten, das ein Tier dazu bringt, Nahrung zu sich zu nehmen, die über den Kalorienbedarf hinausgeht. Umgekehrt können aversive Nahrungsmittelreize und/oder bedrohliche Reize die Nahrungsaufnahme auch im nüchternen Zustand verhindern. Beispielsweise können Hinweise, die auf verdorbenes Essen oder ein in der Nähe befindliches Raubtier hinweisen, zu einem übergeordneten Vermeidungs- bzw. Fluchtverhalten führen, um das Überleben zu sichern. Während allgemein anerkannt ist, dass der Hypothalamus Schlüsselaspekte der homöostatischen Ernährung reguliert4,5,6,7,8 und dass Homöostase-, Belohnungs- und Abneigungswege zusammenlaufen, um die Ernährung zu steuern9,10,11, sind die Schaltkreise, neuronalen Bestandteile und Muster davon Die funktionelle Konnektivität, die das nichthomöostatische Fressverhalten vermittelt, ist weitgehend unbekannt.

Wir und andere haben kürzlich das basale Vorderhirn als Schaltkreisknoten identifiziert, der sich direkt auf die nichthomöostatische Ernährung auswirkt12,13,14. Bemerkenswerterweise zeigten Mäuse schwere, tödliche Hypophagie, wenn erregende, glutamaterge Neuronen des BF genetisch auf eine chronische Aktivierung ausgerichtet wurden. Diese Unterdrückung der Nahrungsaufnahme ging mit einer Abneigung gegen Nahrung und ernährungsbedingte Reize einher. Es wurde festgestellt, dass glutamaterge BF-Projektionen in den lateralen Hypothalamusbereich (LHA) teilweise für die beobachtete Hypophagie und Aversion verantwortlich sind. Die direkte Aktivierung glutamaterger BF-Terminals innerhalb des LHA konnte jedoch die durch die Aktivierung des BF-Zellkörpers angezeigte nahrungsbedingte Aversion nicht vollständig phänokopieren , was darauf hindeutet, dass andere stromabwärts gelegene Ziele des BF zur beobachteten Nahrungsmittelaversion beitragen12.

Durch viral vermittelte anterograde Projektionskartierung haben wir herausgefunden, dass glutamaterge Neuronen des BF auch zur lateralen Habenula (LHb) projizieren, einem prominenten Abneigungszentrum im Gehirn3,15, und dass das LHb sensorische Informationen vom BF erhält. Wenn außerdem BF-zu-LHb-Projektionen aktiviert werden, löst dieser Schaltkreis eine starke, reflexartige Abneigung aus, die das Gedächtnis stört. Dieser Schaltkreis unterdrückt den homöostatischen Drang zum Essen, ohne den Appetit zu beeinträchtigen. Zusammengenommen identifizieren diese Daten einen Gehirnschaltkreis, der das glutamaterge Basalvorderhirn mit dem LHb verbindet, um die Nahrungsaufnahme unabhängig vom homöostatischen Zustand direkt zu modulieren.

Um zu bestimmen, wie vGlut2BF-Neuronen die Einstellung der Nahrungsaufnahme durch Vermeidungs-/Aversionsschaltkreise vorantreiben können, versuchten wir zunächst, nachgeschaltete Effektorziele zu identifizieren, die an aversiven Verhaltensweisen beteiligt sind. Zu diesem Zweck führten wir eine anterograde Projektionskartierung durch, indem wir stereotaktisch ein Cre-abhängiges Synaptophysin::mRuby2-Adeno-assoziiertes Virus (rAAV-Ef1α-flex-Synaptophysin::mRuby2) in das basale Vorderhirn von vGlut2-Cre+/−-Mäusen injizierten, was eine Identifizierung ermöglichte von präsynaptischen BF-Terminals und ihren mutmaßlichen nachgeschalteten Zielen (Abb. 1a, b). Wir beobachteten zahlreiche Termini in zuvor beschriebenen Regionen mit bekannter glutamaterger BF-Eingabe, einschließlich des lateralen Hypothalamusbereichs (LHA), den wir zuvor untersucht hatten (Abb. 1c, Supp. Abb. 112). Bemerkenswerterweise wurde die laterale Habenula (LHb) durch BF-Projektionen stark innerviert (Abb. 1d). Da bekannt ist, dass die laterale Habenula aversives Verhalten auslöst3,15, untersuchten wir die Konnektivität von vGlut2BF zu LHb (vGlut2BF→LHb) als möglichen Schaltkreis zur Vermittlung von Abneigung und Nahrungsunterdrückung.

Glutamaterge BF-Neuronen innervieren das LHb robust und sind funktionell mit glutamatergen LHb-Neuronen verbunden. (a) Versuchsaufbau für die anterograde Verfolgung von vGlut2BF-Zellen. (b) Repräsentatives virales Targeting von Cre-abhängigem Synaptophysin::mRuby2 zum basalen Vorderhirn (BF, Bregma 0,62). Maßstabsbalken = 300 μm. (c) Quantifizierung verschiedener Gehirnregionen, die glutamatergen BF-Input erhalten. Quantifizierung berechnet als Dichte der Syn::mRuby2+-Terminals/Volumen des ROI. PC, piriformer Kortex; LHb, laterale Habenula; LHA, lateraler Hypothalamusbereich; VMH, ventromedialer Hypothalamus; DMH, dorsomedialer Hypothalamus; VTA, ventraler tegmentaler Bereich; PAG, periaquäduktales Grau; PMN, prämamillärer Kern; IPR, interpedunkulärer Kern. (d) Synaptophysin::mRuby2-Projektionsterminals in der lateralen Habenula (LHb) (Bregma − 1,82). ii) Vergrößerter Einschub. MHb, mediale Habenula. (e) Experimenteller Aufbau eines Channelrhodopsin-unterstützten Schaltkreiskartierungsexperiments, bei dem vGlut2+-BF-Terminals stimuliert werden, während von mRuby+/vGlut2+-Zellen im LHb aufgezeichnet wird. (f) ChR2-EYFP-Fasern aus den vGlut2BF-Neuronen, die im LHb enden. mRuby+ vGlut2LHb-Zellen im LHb überlappen mit ChR2-exprimierenden BF-Projektionen. (g) Repräsentative elektrophysiologische Ex-vivo-Spur der mRuby+-Zelle im LHb. Liquor, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (Kontrolle). TTX (1 μM), 4-AP (0,5 μM) und CNQX/AP5 (10 μM/50 μM) wurden nacheinander hinzugefügt. (h) Strommessungen (pA) von mRuby+ LHb-Zellen nach optogenetischer Stimulation der BF-Terminals in (1) aCSF (− 320,20 ± 71,30 pA), (2) + TTX (− 44,20 ± 19,20 pA), (3) + 4AP ( − 243,10 ± 47,08 pA) und (4) + CNQX/AP5 (− 20,43 ± 4,64 pA). Fehlerbalken stellen SEM dar. Statistischer Vergleich unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA, bei der alle Gruppen mit der aCSF-Kontrollgruppe verglichen werden. aCSF vs. TTX: p = 0,0010, aCSF vs. + 4AP: p = 0,5496, aCSF vs. + CNQX/AP5: p = 0,0013. n = 12 für aCSF, n = 10 für TTX, n = 11 für 4AP und n = 7 für CNQX/AP5. (i) Durchschnittliche Amplitude von mRuby+ LHb-Zellen in aCSF und mit der Zugabe von TTX und 4AP. Fehlerbalken stellen SEM dar. n = 12 bzw. 11. aCSF = − 320,20 ± 71,30 pA, + TTX/4AP = − 243,10 ± 47,08 pA. Statistisch verglichen mit einem ungepaarten t-Test, p = 0,3859. (j) Durchschnittliche Latenz bis 10 % des maximalen Stroms von mRuby+ LHb-Zellen bei Photostimulation der BF-Terminals (5,940 ± 0,04 ms). Fehlerbalken stellen SEM dar. n = 15.

Um die anatomischen Verfolgungsdaten zu unterstützen, haben wir als nächstes getestet, ob das basale Vorderhirn und die laterale Habenula funktionell miteinander verbunden sind. Da frühere Studien zeigten, dass das LHb hauptsächlich vGlut2+-Zellen enthält16, injizierten wir ein AAV, das Cre-abhängiges Channelrhodopsin (ChR2) exprimiert, in das BF (rAAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA) und ein Cre-abhängiges mRuby2-Reportervirus in das LHb (rAAV-Ef1α-flex-mRuby2) von vGlut2-Cre+/−-Tieren (Abb. 1e, f). Anschließend haben wir vGlut2BF-Neuronen, die zum LHb projizieren, selektiv fotostimuliert und gleichzeitig visuell geführte Ganzzellaufzeichnungen von mRuby+ vGlut2+-Zellen innerhalb des LHb gemacht. In aufgezeichneten LHb-Zielneuronen beobachteten wir eine robuste Depolarisation mit vGlut2BF-Photostimulation mit einer durchschnittlichen Amplitude von –320,20 ± 71,30 pA (Abb. 1g – i). Darüber hinaus betrug die durchschnittliche Latenz vom Ende eines 473-nm-Lichtimpulses bis zu 10 % Maximalstrom 5,94 ± 0,039 ms, was auf eine monosynaptische Verbindung schließen lässt (Abb. 1j). Darüber hinaus zeigte die Durchführung von Aufzeichnungen in Gegenwart von TTX und 4-AP, dass die vGlut2BF→LHb-Verbindungen monosynaptisch waren (Abb. 1g – i). Diese Reaktion wurde in Gegenwart der AMPA- und NMDA-Rezeptorantagonisten CNQX und APV aufgehoben, was auf eine glutamaterge Reaktion hinweist (Abb. 1g, h). Insgesamt zeigen diese Daten, dass vGlut2LHb-Zellen eine robuste Innervation von vGlut2BF-Neuronen erhalten und dass diese Knoten monosynaptisch verbunden sind.

Zusätzlich zur Unterdrückung und Abneigung gegen Nahrungsaufnahme reagieren vGlut2BF-Neuronen auch auf verschiedene sensorische Reize, einschließlich aversiver und nahrungsbezogener Geruchsreize12,17,18. Da BF und LHb funktionell miteinander verbunden sind, wollten wir als Nächstes herausfinden, ob BF-Projektionen auf das LHb oder auf Neuronen innerhalb des LHb selbst auf sensorische Informationen reagieren. Aufgrund der Fülle und Vielfalt flüchtiger Geruchsstoffe und weil bekannt ist, dass bestimmte Gerüche für Mäuse von Natur aus aversiv, appetitanregend oder belohnend sind19,20,21, präsentierten wir olfaktorische Reize, während wir die neuronale Aktivität der vGlut2BF-Axonterminals innerhalb des LHb aufzeichneten. Zu diesem Zweck zielten wir auf die Expression von Cre-abhängigem GCaMP8 (rAAV-Synapsin-flex-jGCaMP8s) auf vGlut2BF-Neuronen und führten eine Faserphotometrie im LHb durch, während wir entweder appetitanregende nahrungsmittelbedingte19,20 oder von Natur aus aversive Gerüche (Fuchsurin, verdorbenes Essen) präsentierten Geruch und Spuren von Aminen19,21) unter Verwendung eines zuvor beschriebenen kontinuierlichen Durchflussolfaktometers (Abb. 2a, b, Supp. Abb. 2a22). Die Duftstoffe wurden jeweils 2 s lang in 10er-Replikaten in zufälliger Reihenfolge präsentiert, und zwischen den Geruchspräsentationen lag ein Abstand von 18 s.

Glutamaterge BF-zu-LHb-Projektionen und LHb-Zellen, die BF-Input erhalten, reagieren auf aversive und nahrungsmittelbezogene sensorische Reize. (a) Versuchsaufbau für faserphotometrische Aufnahmen. (b) Versuchsaufbau zur Aufzeichnung der vGlut2BF-Axonterminals im LHb und repräsentatives Bild des Glasfaser-Targetings (Bregma − 1,58). (c) Durchschnittliche Z-Score dF/F-Spuren von vGlut2BF→LHb-Axonterminals (in schwarz) über biologische Replikate (n = 12). Der graue Umriss stellt das 95 %-KI dar. Das rosa Kästchen steht für eine Geruchsabgabe von 2 Sekunden. Die Wärmekarte zeigt jede Präsentation eines bestimmten Geruchs (10 Wiederholungen pro Geruch) bei allen 12 Mäusen. Gelb = 1 (maximale Aktivität), dunkelblau = 0 (minimale Aktivität). Von MATLAB generierte Wärmekarte (Version R2019a; https://www.mathworks.com/products/matlab.html). (d) Mittlere Geruchsreaktion von BF-Terminals, aufgezeichnet mittels Faserphotometrie. Fehlerbalken stellen SEM dar. n = 12. Mittlere Z-Score dF/F-Geruchsreaktionen: Mineralöl = 0,19 ± 0,22 (p = 0,41), Fuchsurin = 0,74 ± 0,22 (p = 0,0070), Chow = 0,79 ± 0,35 (p = 0,048), Methylbutylamin = 0,80 ± 0,36 (p = 0,047), Cadaverin = 0,73 ± 0,23 (p = 0,0087), Buttersäure = 0,84 ± 0,28 (p = 0,013). (e) Mittlere Geruchsreaktionsfläche unter der Kurve (AUC) von BF-Terminals, aufgezeichnet mittels Faserphotometrie. Fehlerbalken stellen SEM dar. n = 12. Mittlere AUC der Z-Score-dF/F-Geruchsreaktionen: Mineralöl = 78,61 ± 80,24 (p = 0,35), Fuchsurin = 273,0 ± 82,50 (p = 0,0070), Chow = 289,1 ± 131,1 (p = 0,049) , Methylbutylamin = 302,0 ± 127,6 (p = 0,037), Cadaverin = 256,9 ± 85,95 (p = 0,012), Buttersäure = 312,7 ± 103,5 (p = 0,012). (f) Versuchsaufbau für faserphotometrische Aufzeichnungen von LHb-Zellen, die BF-Eingang mit AAV1-Cre empfangen, und repräsentatives Bild des faseroptischen Targetings (Bregma − 1,58). (g) Durchschnittliche Z-Score-dF/F-Spuren von LHb-Zellen, die BF-Input erhalten (in Schwarz), über biologische Replikate hinweg (n = 6). Der graue Umriss stellt das 95 %-KI dar. Das rosa Kästchen steht für eine Geruchsabgabe von 2 Sekunden. Die Wärmekarte zeigt jede Präsentation eines bestimmten Geruchs (10 Wiederholungen) bei allen 6 Mäusen. Gelb = 1 (maximale Aktivität), dunkelblau = 0 (minimale Aktivität). Von MATLAB generierte Wärmekarte (Version R2019a; https://www.mathworks.com/products/matlab.html). (h) Mittlere Geruchsreaktion von LHb-Zellen, die BF-Input erhalten, aufgezeichnet mittels Faserphotometrie. Fehlerbalken stellen SEM dar. n = 6. Mittlere Z-Score dF/F-Geruchsreaktionen: Mineralöl: − 0,14 ± 0,34 (p = 0,69), Fuchsurin = 0,85 ± 0,29 (p = 0,033), Chow = 1,83 ± 0,10 (p = < 0,0001) , Methylbutylamin = 1,78 ± 0,18 (p = 0,0002), Cadaverin = 1,66 ± 0,21 (p = 0,0006), Buttersäure = 1,54 ± 0,24 (p = 0,0013). (i) Mittlere Geruchsreaktionsfläche unter der Kurve (AUC) von LHb-Zellen, die BF-Eingabe erhalten, aufgezeichnet mittels Faserphotometrie. Fehlerbalken stellen SEM dar. n = 6. Mittlere AUC der Z-Score-dF/F-Geruchsreaktionen: Mineralöl = − 51,10 ± 123,3 (p = 0,70), Fuchsurin = 306,0 ± 103,0 (p = 0,031), Chow = 680,9 ± 37,48 (p = < 0,0001), Methylbutylamin = 652,9 ± 66,78 (p = 0,0002), Cadaverin = 604,0 ± 76,99 (p = 0,0005), Buttersäure = 553,7 ± 95,45 (p = 0,0021).

Bei der Geruchsabgabe reagierten die vGlut2BF→LHb-Terminals sowohl auf aversive als auch auf lebensmittelbedingte Gerüche, nicht jedoch auf die Mineralölkontrollen (Abb. 2c). Die Quantifizierung photometrischer Aufzeichnungen, einschließlich der durchschnittlichen Geruchsreaktion und der durchschnittlichen Fläche unter der Kurve (AUC), ergab, dass vGlut2BF→LHb-Neuronen sowohl durch Lebensmittel als auch durch angeboren aversive Gerüche in ähnlichem Maße aktiviert wurden (Abb. 2d, e, Supp. Abb. 3). ). Beim Vergleich der von der Grundlinie subtrahierten Z-Score-Werte der durchschnittlichen Geruchsreaktionen beispielsweise zeigten vGlut2BF→LHb-Terminals eine um 0,80 ± 0,36 (p = 0,047) erhöhte Fluoreszenz für das Spurenamin Methylbutylamin und eine um 0,79 ± 0,35 (p = 0,048) erhöhte Fluoreszenz Chow-Duftstoff (Abb. 2d). VGlut2BF-Projektionen auf das LHb reagierten weniger wahrscheinlich auf neutrale Gerüche und reagierten nicht auf den appetitlichen, wohlschmeckenden Lebensmittelduftstoff Erdnussbutter (Supp. Abb. 4). Daher scheinen vGlut2BF-Projektionen auf das LHb sowohl auf aversive als auch auf appetitliche sensorische Informationen zu reagieren. Angesichts der breiten Reaktionen der vGlut2BF→LHb-Terminals stellten wir als nächstes die Frage, inwieweit Neuronen im LHb diese sensorischen Informationen empfangen und direkt darauf reagieren. Zu diesem Zweck richteten wir stereotaktisch ein anterogrades, transsynaptisches Cre (rAAV1-hSyn-Cre)23 auf den BF von Wildtyp-Tieren (C57BL/6NJ) und injizierten und implantierten gleichzeitig das LHb mit Cre-abhängigen GCaMP8s (rAAV-Synapsin-flex- jGCaMP8s) und ein faseroptisches Implantat für photometrische Aufnahmen (Abb. 2f, Supp. Abb. 2b). Dies ermöglichte uns die Aufzeichnung von LHb-Zielzellen, die synaptische BF-Eingaben empfangen. In Übereinstimmung mit dem, was wir anhand der Photometriereaktionen in vGlut2BF-Terminals beobachtet haben, stellten wir in LHb-Neuronen starke Geruchsreaktionen sowohl auf aversive als auch auf lebensmittelbedingte Gerüche fest (Abb. 2g – i, Supp. Abb. 5). Beim Vergleich der von der Grundlinie subtrahierten Z-Score-Werte der durchschnittlichen Geruchsreaktionen zeigten beispielsweise LHb-Zellen, auf die AAV1-Cre im BF abzielte, eine um 1,78 ± 0,18 (p = 0,0002) erhöhte Fluoreszenz gegenüber dem Spurenamin Methylbutylamin und um 1,83 ± 0,10 ( p = < 0,0001) zum Chow-Geruch (Abb. 2h). LHb-Zellen, die BF-Input erhielten, schienen auch auf mehrere neutrale Gerüche und auf den appetitanregenden, schmackhaften Lebensmittelduftstoff Erdnussbutter zu reagieren (Supp. Abb. 6). Somit leiten vGlut2BF→LHb-Projektionen eine breite Palette sensorischer Informationen weiter, darunter sowohl appetitliche/lebensmittelbezogene als auch aversive Signale an das LHb, das auch auf verschiedene olfaktorische Reize reagiert.

Wir haben den glutamatergen BF als einen wichtigen Knoten bei der Unterdrückung der Nahrungsaufnahme und der Antriebsaversion identifiziert und gezeigt, dass vGlut2BF-Neuronen robuste Projektionen an den LHb senden. Daher wollten wir herausfinden, ob die vGlut2BF→LHb-Konnektivität die Nahrungsaufnahme moduliert. Zu diesem Zweck zielten wir stereotaktisch auf ein AAV ab, das Cre-abhängiges Channelrhodopsin2-EYFP (rAAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP)24 oder Cre-abhängiges GFP als Kontrolle (rAAV-EF1α-flex-GFP) exprimiert BF von vGlut2-Cre+/− Tieren. ChR2-EYFP, das membrangebunden ist, markierte BF→LHb-Projektionen auf ähnliche Weise robust wie die Synaptophysin::mRuby2-Markierung (Abb. 1d). Da ChR2 jedoch membranlokal lokalisiert ist, wurden auch Durchgangsfasern vom BF zum LHb sichtbar gemacht, die durch den Thalamus verlaufen. Über dem LHb wurden Glasfasern implantiert, um ChR2-exprimierende vGlut2BF-Terminals im LHb selektiv zu stimulieren (Abb. 3a, b, Supp. Abb. 7).

Die Aktivierung lateraler Habenula-projizierender glutamaterger basaler Vorderhirnneuronen reduziert die Nahrungsaufnahme und fördert die Abneigung. (a) Versuchsaufbau für optogenetisches Verhalten in vivo, bei dem vGlut2BF-Terminals im LHb aktiviert werden. (b) Repräsentative Bilder, die ein Glasfaserimplantat zeigen, das auf BF-Terminals im LHb abzielt. In Bregma aufgenommene Bilder − 1,46. ii) Vergrößerter Einschub. (c) Experimenteller Zeitplan für den Re-Feeding-Assay mit und ohne optogenetische Stimulation von vGlut2BF→LHb-Zellen. Durchschnittliche Futteraufnahme (g) an Futter, gemessen in 5-minütigen Stimulations-/kein-Stimulations-Intervallen während der Dauer eines 20-minütigen Nachfütterungsexperiments. Ausgefüllte Symbole stellen gemittelte Werte dar, während leere/transparente Symbole einzelne biologische Replikate darstellen. Statistische Signifikanz berechnet anhand der Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen und Sidak-Korrektur für mehrere Vergleiche. Fehlerbalken stellen SEM dar. n = 7. Bei 5 Minuten Stimulationszeitraum: GFP-Kontrollen = 0,12 ± 0,021 g, ChR2-Tiere = 0,05 ± 0,019 g, p = 0,0078. Nach 10 Minuten ohne Stimulation: GFP-Kontrollen = 0,07 ± 0,008 g, ChR2 = 0,100 ± 0,018 g, p = 0,6608. Bei einem Stimulationszeitraum von 15 Minuten: GFP-Kontrollen = 0,07 ± 0,016 g, CHR2 = 0,03 ± 0,008 g, p = 0,2345. Bei einem Zeitraum von 20 Minuten ohne Stimulation: GFP-Kontrollen = 0,06 ± 0,013 g, ChR2 = 0,097 ± 0,020 g, p = 0,3297. (d) Versuchsaufbau für einen Echtzeit-Ortsvermeidungstest mit optogenetischer Stimulation. (e) Wärmekarten, die die Bewegung repräsentativer GFP-Kontroll- und ChR2-EYFP-Mäuse während des Echtzeit-Platzvermeidungstests zeigen, bei dem Mäuse auf der rechten Seite der Kammer stimuliert wurden. Mit der Software Noldus Noldus EthoVision (XT 16; https://www.noldus.com/ethovision-xt) erstellte Wärmekarten. (f) Durchschnittlicher Prozentsatz der Zeit, die GFP-Kontrollen und ChR2-EYFP-exprimierende Tiere während eines 20-minütigen Experiments auf nicht stimulierten oder stimulierten Seiten der Arena verbrachten. Statistische Signifikanz bestimmt mittels Binomialtest für Proportionen mit Bonferroni-Korrektur; Nullhypothese = 50 %. Fehlerbalken stellen SEM dar. n = 7. Bei den GFP-Kontrollen verbrachten sie 47,68 ± 1,98 % ihrer Zeit auf der nicht stimulierten Seite und 51,32 ± 1,97 % auf der stimulierten Seite, p = 0,7644. Für ChR2: 71,07 ± 4,70 % Zeit auf der Nicht-Stimulationsseite, 27,84 ± 4,82 % auf der Stimulationsseite, p < 0,0001. (g) Durchschnittliche Dauer jedes Besuchs auf der Stimulationsseite der Kammer. Statistische Signifikanz bestimmt mit ungepaartem, zweiseitigem t-Test. GFP-Kontrollen = 17,50 ± 3,98 s, ChR2 = 7,71 ± 1,79 s, p = 0,0447. n = 7. (h) Anzahl der Besuche in der Stimulationszone. Statistische Signifikanz bestimmt mit ungepaartem, zweiseitigem t-Test. GFP-Kontrollen = 42,00 ± 5,52 Besuche, ChR2 = 56,29 ± 9,05 Besuche, p = 0,2026 (nicht signifikant). n = 7.

Um die Wirkung der vGlut2BF→LHb-Aktivierung auf das Fressverhalten zu testen, wurden Mäuse über Nacht fasten gelassen und dann mit 470-nm-Licht bei 20 Hz (der maximalen Feuerrate von vGlut2BF-Neuronen25) mit 5-ms-Impulsen für 5 Minuten stimuliert, gefolgt von 5-minütigen Ausschaltperioden während ihm Essen präsentiert wird. Die Nahrungsaufnahme wurde alle 5 Minuten über einen Zeitraum von insgesamt 20 Minuten gemessen (Abb. 3c). ChR2-exprimierende Mäuse reduzierten ihre Nahrungsaufnahme während Perioden der Photostimulation drastisch um ~ 50 %, konsumierten jedoch in Perioden ohne Photostimulation genauso viel Nahrung wie Kontrolltiere (Abb. 3c; ChR2-EYFP-Mäuse konsumierten 0,05 ± 0,02 g Futter, während GFP-Kontrollen konsumierten 0,12 ± 0,02 g im ersten Stimulationszyklus (p = 0,0078)). Somit verhinderte die selektive Aktivierung der vGlut2BF→LHb-Terminals vorübergehend und deutlich die Nahrungsaufnahme bei nüchternen Tieren, doch unmittelbar nach Beendigung der Photostimulation setzte das normale, unverminderte Fressverhalten wieder ein.

Da gezeigt wurde, dass der glutamaterge BF Aversion vermittelt12,26, fragten wir als nächstes, ob die optogenetische Aktivierung von vGlut2BF→LHb-Terminals aversives Verhalten vermittelt. Um dies zu testen, unterzogen wir optogenetische Mäuse mit LHb-Implantation (Abb. 3a, b) einem Echtzeit-Platzvermeidungstest, bei dem Mäuse in einer Hälfte einer nicht markierten Arena (Abb. 3d). Die Mäuse wurden per Video aufgezeichnet und die Zeit, die sie in beiden Hälften der Arena verbrachten, wurde nachträglich analysiert. GFP-exprimierende Kontrollmäuse verbrachten die gleiche Zeit auf beiden Seiten der Kammer (51,32 ± 1,97 % auf der Stimulationsseite, 47,68 ± 1,98 % Zeit auf der Nichtstimulationsseite, p = 0,7644). Allerdings zeigten ChR2-exprimierende Mäuse eine offensichtliche Abneigung gegen den Bereich der Arena, der für die Photostimulation der vGlut2BF→LHb-Schaltkreise programmiert ist, und verbrachten deutlich weniger Zeit auf der Stimulationsseite als auf der Nichtstimulationsseite (27,84 ± 4,82 % auf der Stimulationsseite, 71,1 ± 4,7 % auf der Nichtstimulationsseite, p = < 0,0001; Abb. 3e, f). Darüber hinaus war die durchschnittliche Besuchsdauer auf der Stimulationsseite bei ChR2-Mäusen im Vergleich zu GFP-Kontrollen deutlich kürzer (7,71 ± 1,79 s für ChR2-EYFP-Mäuse, 17,5 ± 3,98 s für GFP-Kontrollen, p = 0,0447; Abb. 3g). GFP-Kontrollen und ChR2-EYFP-Mäuse hatten jedoch eine ähnliche Anzahl von Besuchen in der Stimulationszone (Abb. 3h), was darauf hindeutet, dass sich ChR2-Mäuse trotz der hervorgerufenen Abneigung weiterhin in die Stimulationszone wagten. Zusammengenommen deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass der vGlut2BF→LHb-Schaltkreis eine offensichtliche Ortsaversion in Echtzeit auslöst, da ChR2-Mäuse während eines Echtzeit-Ortsvermeidungstests insgesamt weniger Zeit verbringen und kürzere Besuche in der Stimulationszone absolvieren.

Aufgrund des dramatischen Aversionsphänotyps, der bei der Aktivierung des vGlut2BF→LHb-Schaltkreises beobachtet wird, stellten wir als nächstes die Frage, ob dieser Schaltkreis nach assoziativer Konditionierung zu erlernten aversiven Reaktionen führen würde. Um dies zu testen, haben wir vGlut2BF→LHb-Neuronen optogenetisch aktiviert, als sich die Tiere in einer Hälfte einer Arena befanden, die einen Kontextmarker enthielt (Wände mit Streifenmuster; Abb. 4a), und anschließend ihre Fähigkeit gemessen, den Hinweis mit der fotostimulierten Abneigung von vGlut2BF zu verknüpfen →LHb-Schaltkreis. Zu diesem Zweck wurden Mäuse drei Tage hintereinander 20 Minuten pro Tag unter Verwendung eines Paradigmas der konditionierten Ortsaversion trainiert (Abb. 4a). Am Testtag (Tag 4) wurden die Tiere in die gleiche Kammer wie an den vorangegangenen Tagen gebracht, jedoch keiner Photostimulation unterzogen. Die Gesamtaktivität wurde 20 Minuten lang aufgezeichnet und die auf beiden Seiten der Kammer verbrachte Zeit nachträglich analysiert. Obwohl Mäuse während eines Echtzeit-Ortsvermeidungstests einer Photostimulation abgeneigt waren (Abb. 3d–h), lernten sie am Testtag nach dem konditionierten Ortspräferenztraining nicht, die markierte Seite einer Arena zu meiden, und verbrachten fast 50 Prozent ihrer Zeit Zeit in beiden Hälften der Arena (Abb. 4b; ChR2-EYFP-Mäuse verbrachten 46,43 ± 3,96 % ihrer Zeit auf der nicht gestreiften Seite und 50,78 ± 4,07 % ihrer Zeit auf der gestreiften/zuvor stimulierten Seite, p = 0,6137) . Als Positivkontrolle, um zu überprüfen, ob optogenetische vGlut2BF→LHb-Mäuse aufgrund der invasiven Faserimplantate und/oder der Virusinjektion keine Beeinträchtigung der Gedächtnisbildung aufwiesen, führten wir eine kontextuelle Angstkonditionierung unter Verwendung eines Fußschocks ohne Photostimulation durch (Supp. Abb. 8a). Alle Mäuse zeigten sowohl 2 als auch 24 Stunden nach der Konditionierung einen signifikanten Anstieg des Prozentsatzes des Einfrierens in der Fußschock-Konditionierungskammer (Supp. Abb. 8b), was darauf hinweist, dass vGlut2BF→LHb-optogenetische Mäuse über intakte Lern- und Gedächtnisschaltkreise verfügen.

Die optogenetische Stimulation der Schaltkreise vom basalen Vorderhirn zur seitlichen Habenula beeinträchtigt die Gedächtnisbildung. (a) Kontextbedingtes experimentelles Paradigma der bedingten Ortspräferenz mit optogenetischer Stimulation. (b) Durchschnittlicher Prozentsatz der Zeit, die optogenetische GFP- und ChR2-EYFP-Tiere am Testtag auf beiden Seiten der kontextbedingten Ortspräferenzarena verbrachten, ohne Photostimulation. Statistische Signifikanz bestimmt mittels Binomialtest für Proportionen mit Bonferroni-Korrektur; Nullhypothese = 50 %. Fehlerbalken stellen SEM dar. n = 7. Bei den GFP-Kontrollen verbrachten sie 48,66 ± 2,798 % in der Nicht-Stimulationszone, 48,7 ± 2,83 % in der Stimulationszone, p = 0,99. Bei ChR2-Tieren verbrachten sie 46,43 ± 3,958 % auf der nicht stimulierten Seite, 50,78 ± 4,07 % auf der stimulierten Seite, p = 0,6137. (c) Neuartiges experimentelles Paradigma zur Objekterkennung. In der Photostimulationsversion dieses Paradigmas wurden Mäuse nach einer 10-minütigen Trainingseinheit mit zwei identischen Objekten 10 Minuten lang photostimuliert (20 Hz, 5 ms Impulse). Einen Tag später wurde an Mäusen getestet, wie gut sie zwischen einem neuen und einem bekannten Objekt unterscheiden konnten. (d) Diskriminierungsindex (berechnet als: [(Zeit für die Untersuchung eines neuartigen Objekts – Zeit für die Untersuchung eines vertrauten Objekts)/Gesamtuntersuchungszeit]*100) am Testtag der Erkennung neuartiger Objekte. Ein Diskriminierungsindex über 0 weist erwartungsgemäß auf eine Präferenz für die Untersuchung eines neuartigen Objekts hin. DI für GFP-Stimulation = 33,53 ± 3,80 %. DI für ChR2-Stimulation = 0,049 ± 7,38 %. DI für GFP ohne Stimulation = 33,91 ± 7,13 %, DI für ChR2 ohne Stimulation = 28,55 ± 4,29 %. Statistische Signifikanz berechnet unter Verwendung einer Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen und einer Bonferroni-Mehrfachvergleichskorrektur. GFP-Stim vs. ChR2-Stim p = 0,0023. GFP ohne Stimulation vs. ChR2 ohne Stimulation p = > 0,9999. ChR2-Stimulation vs. ChR2 ohne Stimulation p = 0,0113. GFP-Stimulation vs. GFP ohne Stimulation p = > 0,9999.

Aufgrund des Fehlens einer konditionierten Ortspräferenz trotz starker Abneigung, die durch die optogenetische Stimulation des vGlut2BF→LHb-Schaltkreises hervorgerufen wird, fragten wir uns, ob dieser Schaltkreis das Lernen und die Erinnerung an einen aversiven Zustand und/oder Ort umgeht oder ob er möglicherweise die Gedächtnisbildung stört. Um dies zu testen, führten wir eine neuartige Objekterkennungs-Gedächtnisaufgabe durch, bei der der Objektpräsentation eine optogenetische Stimulation folgte (um den Trainingsprozess nicht zu beeinträchtigen). Interessanterweise unterschieden ChR2-exprimierende Mäuse kein „vertrautes“ Objekt von einem neuen Objekt, mit einem Unterscheidungsindex von 0,049 ± 7,38 %, was darauf hindeutet, dass die Stimulation der vGlut2BF→LHb-Schaltkreise die Gedächtnisbildung blockiert. Dieser Effekt war reversibel, da dieselben Tiere beim Training ohne Photostimulation ausreichend zwischen neuen und bekannten Objekten unterscheiden konnten (Abb. 4c, d). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass der vGlut2BF→LHb-Schaltkreis zwar eine starke Abneigung vermittelt, diese Abneigung jedoch nicht in einer Erinnerung geformt wird und nicht wie viele andere Arten aversiver Verhaltensweisen mit kontextuellen Hinweisen in Verbindung gebracht werden kann. Darüber hinaus hemmt die Stimulation dieses Schaltkreises nach dem Training aktiv die Gedächtnisbildung.

Aufgrund des dramatischen Aversionsphänotyps, der bei der Aktivierung von vGlut2BF→LHb-Neuronen beobachtet wird, fragten wir als Nächstes, ob die Aktivierung dieser Schaltkreise eine Stress- oder Kampf-oder-Flucht-ähnliche Reaktion hervorruft, die für andere hochaversive Zustände typisch ist. Um dies zu testen, haben wir die Spiegel der Plasmahormone ACTH, Corticosteron, Noradrenalin und Adrenalin nach optogenetischer Aktivierung von vGlut2BF→LHb-Neuronen untersucht. Zu Beginn (ohne optogenetische Stimulation) wurde Blut gesammelt, unmittelbar nach 5 Minuten Photostimulation, um schnell wirkende Kampf-oder-Flucht-Reaktionen zu erkennen, und 20 Minuten nach einer 5-minütigen Photostimulationsperiode, um mögliche langsamer wirkende Stressreaktionen zu identifizieren. Zwischen den einzelnen Zeitpunkten lagen zwei Wochen, um eine vollständige Genesung zu ermöglichen und eine Verwechslung späterer Zeitpunkte zu vermeiden (Abb. 5a). Nach der Isolierung des Plasmas aus dem gesammelten Gesamtblut haben wir ACTH und Corticosteron mithilfe von Radioimmunoassays und Katecholamine mithilfe von HPLC gemessen. Wichtig ist, dass es zu Studienbeginn keine Unterschiede im Hormonspiegel zwischen GFP-Kontrollen und ChR2-EYFP-Versuchstieren gab (ohne optogenetische Stimulation; Abb. 5b). Interessanterweise konnten wir bei keinem der unmittelbar nach der Stimulation oder 20 Minuten nach der Stimulation gemessenen Hormone größere Unterschiede zwischen GFP-Kontrollen und ChR2-EYFP-Mäusen feststellen (Abb. 5c, d). Tatsächlich zeigten einige Hormone, wie zum Beispiel Adrenalin, im Verlauf des Experiments einen Rückgang der Spiegel, dieser Effekt wurde jedoch sowohl in der GFP- als auch in der ChR2-EYFP-Gruppe beobachtet, was möglicherweise auf eine Gewöhnung an die Blutentnahme hindeutet (Abb. 5d). Somit löst die Aktivierung von vGlut2BF→LHb-Neuronen ein robustes aversives Verhalten aus, ohne eine Stress- oder Kampf-oder-Flucht-Reaktion auszulösen. Neben Beweisen dafür, dass dieser durch Fotos hervorgerufene aversive Zustand nicht kontextualisiert werden kann und das Gedächtnis beeinträchtigt (Abb. 4), deuten diese Daten darauf hin, dass der vGlut2BF→LHb-Schaltkreis eine sofortige, „reflexartige“ Aversionsreaktion induziert.

Die durch die Aktivierung des basalen Vorderhirns zur lateralen Habenula hervorgerufene Abneigung ruft keine Stressreaktion hervor. (a) Experimentelles Paradigma für die Plasmasammlung zu Studienbeginn, nach der Stimulation und 20 Minuten nach der Stimulation. Jeder Zeitpunkt liegt im Abstand von 2 Wochen. (b) Ausgangshormonspiegel aller Hormone, gemessen für GFP-Kontrollen und ChR2-EYFP-Tiere. Statistische Tests mit mehreren ungepaarten T-Tests. Fehlerbalken stellen SEM dar. n = 6 für GFP-Kontrollen, n = 7 für ChR2-EYFP-Tiere. Für ACTH: GFP-Kontrollen = 504,03 ± 158,94 pg/ml, ChR2-Tiere = 444,82 ± 146,80 pg/ml (p = 0,9799). Für Corticosteron: GFP-Kontrollen = 437,74 ± 93,38 ng/ml, ChR2-Tiere = 376,45 ± 60,59 ng/ml (p = 0,9111). Für Adrenalin: GFP-Kontrollen = 677,17 ± 115,04 pg/ml, ChR2-Tiere = 639,29 ± 126,13 pg/ml (p = 0,9950). Für Noradrenalin: GFP-Kontrollen = 873,17 ± 89,83 pg/ml, ChR2-Tiere = 719,29 ± 94,81 pg/ml (p = 0,6007). (c) Hormonspiegel zu Studienbeginn, nach der Stimulation und 20 Minuten nach der Stimulation für die Stressreaktionshormone ACTH und Corticosteron. Statistische Signifikanz bestimmt anhand wiederholter Messungen. Zweifaktorielle ANOVA mit einer Sidak-Korrektur für mehrere Vergleiche. n = 6 für GFP-Kontrollen, n = 7 für ChR2-EYFP-Tiere. Für ACTH: GFP-Kontrollen zu Studienbeginn = 504,03 ± 158,94 pg/ml, ChR2-EYFP-Tiere zu Studienbeginn = 444,82 ± 145,80 pg/ml, p = 0,9799. GFP-Kontrollen nach der Stimulation = 586,11 ± 129,50 pg/ml, ChR2-EYFP nach der Stimulation = 719,61 ± 77,57 pg/ml, p = 0,8197. GFP-Kontrollen 20 Minuten nach der Stimulation = 630,24 ± 98,01 pg/ml, ChR2-EYFP 20 Minuten nach der Stimulation = 628,4 ± 89,46 pg/ml, p = > 0,999. Für Corticosteron: GFP-Kontrollen zu Studienbeginn = 437,74 ± 93,38 ng/ml, ChR2-EYFP-Tiere zu Studienbeginn = 376,45 ± 60,59 ng/ml, p = 0,9111. GFP-Kontrollen nach der Stimulation = 409,17 ± 92,20 ng/ml, ChR2-EYFP nach der Stimulation = 455,90 ± 84,11 ng/ml, p = 0,9575. GFP-Kontrollen 20 Minuten nach der Stimulation = 306,86 ± 58,40 ng/ml, ChR2-EYFP 20 Minuten nach der Stimulation = 381,12 ± 33,80 pg/ml, p = 0,8541. (d) Hormonspiegel zu Studienbeginn, nach der Stimulation und 20 Minuten nach der Stimulation für die Kampf-oder-Flucht-Hormone Adrenalin und Noradrenalin. Statistische Signifikanz bestimmt anhand wiederholter Messungen. Zweifaktorielle ANOVA mit einer Sidak-Korrektur für mehrere Vergleiche. n = 6 für GFP-Kontrollen, n = 7 für ChR2-EYFP-Tiere. Für Adrenalin: GFP-Kontrollen zu Studienbeginn = 677,17 ± 115,04, ChR2-EYFP-Tiere zu Studienbeginn = 639,29 ± 126,13, p = 0,9950. GFP-Kontrollen nach Stimulation = 365,50 ± 37,82, ChR2-EYFP-Tiere nach Stimulation = 514,14 ± 53,00, p = 0,1278. GFP-Kontrollen 20 Minuten nach der Stimulation = 364,50 ± 39,10, ChR2-EYFP-Tiere 20 Minuten nach der Stimulation = 438,00 ± 45,31, p = 0,5698. Für Noradrenalin: GFP-Kontrollen zu Studienbeginn = 873,17 ± 89,83, ChR2-EYFP-Tiere zu Studienbeginn = 719,29 ± 94,81, p = 0,6007. GFP-Kontrollen nach Stimulation = 768,83 ± 150,05, ChR2-EYFP-Tiere nach Stimulation = 546,86 ± 42,95, p = 0,4999. GFP-Kontrollen 20 Minuten nach der Stimulation = 628,33 ± 87,80, ChR2-EYFP-Tiere 20 Minuten nach der Stimulation = 431,29 ± 58,80, p = 0,2591.

Angesichts der Tatsache, dass die Aktivierung des vGlut2BF→LHb-Schaltkreises ein starkes Abneigungsverhalten hervorruft und die durch Hunger verursachte Nahrungsaufnahme außer Kraft setzt, fragten wir als Nächstes, ob die optogenetische Aktivierung dieses Schaltkreises ausreichen würde, um zu verhindern, dass nüchterne Mäuse fettreiches Futter (HF; 60 % kcal Fett) zu sich nehmen. was für Mäuse äußerst schmackhaft und lohnend ist. Vor dem Experiment wurden optogenetische vGlut2BF→LHb-Mäuse an HF-Futter gewöhnt, indem sie ihre Ernährung drei Tage lang täglich ergänzten. Über Nacht gefastete Mäuse wurden dann in eine Arena gebracht, wo sich an einem Ende der Arena zwei Futterzonen befanden: eine mit normalem Futter und die andere mit HF-Futter. Beim Betreten einer der Nahrungszonen erhielten die nüchternen Mäuse eine Photostimulation, im Rest der Arena jedoch keine Photostimulation (Abb. 6a). Mäuse wurden per Video aufgezeichnet und der Futterverbrauch insgesamt 20 Minuten lang gemessen. Nach wie vor zeigten ChR2-exprimierende Mäuse eine starke Abneigung gegen die Photostimulationsseite der Kammer und verbrachten die meiste Zeit auf der nicht stimulierten Seite (Abb. 6b; ChR2-Mäuse verbrachten 78,29 ± 1,89 % ihrer Zeit auf der nicht stimulierten Seite Seite im Vergleich zu 11,98 ± 1,60 % ihrer Zeit auf der Stimulations-/Nahrungsseite, p = < 0,0001). ChR2-Mäuse verbrachten pro Besuch auch deutlich weniger Zeit auf der Stimulationsseite der Kammer (Abb. 6c; ChR2-Mäuse verbrachten 2,16 ± 0,33 s pro Besuch, während GFP-Mäuse 16,33 ± 2,3 s pro Besuch verbrachten, p = < 0,0001), und damit weniger Zeit in der Chow- oder HF-Chow-Zone im Vergleich zu GFP-Kontrollen. Tatsächlich verbrachten ChR2-Mäuse 2,80 ± 0,58 % ihrer Zeit in der Chow-Zone und 8,41 ± 1,30 % ihrer Zeit in der HF-Chow-Zone, während GFP-Kontrollen 20,79 ± 2,74 % ihrer Zeit in der Chow-Zone und 26,73 ± 2,45 % ihrer Zeit in der Chow-Zone verbrachten % ihrer Zeit in der HF-Chow-Zone (Abb. 6d). Trotz der Abneigung gegen die Photostimulationszone konsumierten ChR2-Tiere jedoch die gleiche Gesamtmenge an normalem oder HF-Futter wie GFP-Kontrollen (Abb. 6e; GFP-Mäuse konsumierten 0,05 ± 0,03 g Futter und 0,53 ± 0,05 g HF-Futter, während ChR2-Mäuse konsumierten 0,03 ± 0,01 g Futter und 0,36 ± 0,09 g HF Futter). Bemerkenswert ist, dass ChR2-Mäuse die Chow- oder HF-Chow-Zonen viel kürzer besuchten (Abb. 6f) und insgesamt eine weitere Strecke zurücklegten als GFP-Kontrollen (Abb. 6g). Daher passten ChR2-Mäuse ihre Futtersuchstrategie an, um kürzere Fahrten zu Futterzonen zu unternehmen und eine Photostimulation zwischen den Fressgängen zu vermeiden. ChR2-Mäuse unternahmen auch unverhältnismäßig häufiger Fahrten in die HF-Chow-Zone (Abb. 6h). Diese Daten legen nahe, dass sich ChR2-Tiere unter dem Druck der aversiv verbundenen vGlut2BF→LHb-Photostimulation dafür entscheiden, nach kalorienreicherer/lohnenderer Nahrung zu suchen. Darüber hinaus konsumierten ChR2-Mäuse die gleiche Futtermenge wie GFP-Kontrollen in kürzerer Zeit, indem sie kürzere, aber häufigere Fahrten zur Nahrungszone unternahmen und die Nahrung schneller konsumierten. Während diese Daten teilweise die Verhaltensflexibilität von Mäusen zeigen, um bei äußerem Druck effizient Nahrung aufzunehmen, offenbaren sie auch einen grundlegenden Unterschied: Während die durch den vGlut2BF→LHb-Schaltkreis hervorgerufene Abneigung ausreicht, um die Zeit zu reduzieren, die für die Interaktion mit Nahrung aufgewendet wird, und die Nahrungsaufnahme akut zu reduzieren (Abb. 3) Eine vorübergehende Aktivierung dieses Schaltkreises hat keinen Einfluss auf den Appetit. Das heißt, der vGlut2BF→LHb-Schaltkreis treibt eine Abneigung voran, die bei Aktivierung das Fressverhalten außer Kraft setzen kann, aber diese Aktivierung selbst verringert weder den Appetit noch die Motivation zum Essen.

Die Aktivierung lateraler Habenula-projizierender glutamaterger basaler Vorderhirnneuronen überschreibt den Esstrieb, hat jedoch keinen Einfluss auf den Appetit. (a) Versuchsaufbau zur optogenetischen Stimulation von vGlut2BF→LHb-Neuronen gepaart mit Nahrung. (b) Durchschnittlicher Prozentsatz der Zeit, die GFP-Kontrollen und ChR2-EYFP-Tiere während eines 20-minütigen Experiments entweder in den stimulierten oder nicht stimulierten Teilen der Arena verbrachten. Fehlerbalken stellen SEM dar. Statistische Signifikanz bestimmt mittels Binomialtest für Proportionen mit Bonferroni-Korrektur; Nullhypothese = 50 %. n = 7. GFP-Kontrollen verbrachten 43,00 ± 3,45 % der Zeit auf der Nicht-Stimulationsseite und 50,71 ± 3,22 % der Zeit auf der Stimulations-/Nahrungsseite (p = 0,4705). ChR2-EYFP-Tiere verbrachten 78,29 ± 1,89 % der Zeit auf der Nichtstimulationsseite, verglichen mit 11,98 ± 1,60 % der Zeit auf der Stimulations-/Futterseite (p = < 0,0001). (c) Die durchschnittliche Dauer jedes Besuchs auf der Stimulationsseite der Kammer für GFP- und ChR2-EYFP-Tiere. Fehlerbalken stellen SEM dar. Statistische Signifikanz bestimmt mit einem ungepaarten, zweiseitigen t-Test. n = 7. GFP-Tiere verbrachten 16,33 ± 2,3 s pro Besuch. ChR2-EYFP-Tiere verbrachten 2,157 ± 0,33 s pro Besuch. p = < 0,0001. (d) Der Prozentsatz der Zeit, die GFP-Kontrollen und ChR2-EYFP-Tiere mit der Interaktion mit entweder Futter oder fettreichem Futter (innerhalb des Stimulationsteils der Arena) verbracht haben. Fehlerbalken stellen SEM dar. Statistische Signifikanz bestimmt mithilfe der Zwei-Wege-ANOVA mit einer Tukey-Korrektur für mehrere Vergleiche. n = 7. In der Chow-Zone: GFP-Kontrollen verbrachten 20,79 ± 2,74 % Zeit, ChR2-EYFP-Tiere verbrachten 2,80 ± 0,58 % Zeit (p = < 0,0001). In der fettreichen Futterzone: GFP-Kontrollen verbrachten 26,73 ± 2,45 % Zeit, ChR2-EYFP-Tiere verbrachten 8,41 ± 1,3 % Zeit (p = < 0,0001). (e) Durchschnittliche kumulative Nahrungsaufnahme von GFP-Kontrollen und ChR2-EYFP-Tieren während des 20-minütigen Experiments. Fehlerbalken stellen SEM dar. Statistische Signifikanz bestimmt mithilfe der Zwei-Wege-ANOVA mit Tukey-Korrektur für mehrere Vergleiche. n = 7. Verzehrtes Futter: GFP-Kontrollen = 0,05 ± 0,03 g, ChR2-EYFP-Tiere = 0,03 ± 0,01 g (p = 0,9888). Verzehrtes HF-Futter: GFP-Kontrollen = 0,53 ± 0,05 g, ChR2-EYFP-Tiere = 0,36 ± 0,09 g (p = 0,1640). GFP-Chow vs. GFP-HF-Chow: p = < 0,0001. ChR2-Chow vs. ChR2-HF-Chow: p = 0,0013. (f) Die durchschnittliche Dauer jedes Besuchs in der Futterzone oder der Futterzone mit hohem Fettgehalt für GFP-Kontrollen und ChR2-EYFP-Tiere. Fehlerbalken stellen SEM dar. Statistische Signifikanz bestimmt mithilfe der Zwei-Wege-ANOVA mit Tukey-Korrektur für mehrere Vergleiche. n = 7. Durchschnittlicher Besuch in der Futterzone: GFP-Kontrollen = 7,11 ± 0,97 s, ChR2-EYFP-Tiere = 1,43 ± 0,25 s (p = < 0,0001). Durchschnittlicher Besuch in der fettreichen Futterzone: GFP-Kontrollen = 8,49 ± 1,10 s, ChR2-EYFP-Tiere = 2,14 ± 0,31 s (p = < 0,0001). (g) Die durchschnittliche zurückgelegte Distanz von GFP-Kontrollen und ChR2-EYFP-Tieren während des 20-minütigen Lebensmittelauswahlexperiments. Fehlerbalken stellen SEM dar. Statistische Signifikanz bestimmt mit ungepaartem, zweiseitigem t-Test. n = 7. GFP-Kontrollen = 45,66 ± 9,94 m, ChR2-EYFP-Tiere = 82,21 ± 28,33 (p = 0,0074). (h) Die durchschnittliche Anzahl der Besuche der GFP-Kontrollen und ChR2-EYFP-Tiere in der Futterzone oder der Futterzone mit hohem Fettgehalt der Arena. Fehlerbalken stellen SEM dar. Statistische Signifikanz bestimmt mithilfe der Zwei-Wege-ANOVA mit Tukey-Korrektur für mehrere Vergleiche. n = 7. Fahrten in die Chow-Zone: GFP-Kontrollen = 41,43 ± 3,36, ChR2-EYFP = 27,14 ± 2,42 (p = 0,0286). Fahrten in die fettreiche Futterzone: GFP-Kontrollen = 44,7 ± 3,1, ChR2-EYFP-Tiere = 55,57 ± 4,31 (p = 0,1285). Vergleich von GFP-Chow mit GFP-HF-Chow: p = 0,8987. Vergleich von ChR2-EYFP-Chow mit ChR2-EYFP-HF-Chow: p = < 0,0001.

Während Channelrhodopsin aufdeckt, ob ein Schaltkreis für ein bestimmtes Verhalten ausreicht, haben wir auch die Notwendigkeit eines vGlut2BF→LHb-Schaltkreises für Abneigung und Fressverhalten durch optogenetische Hemmung getestet, indem wir Cre-abhängiges Archaerhodopsin (ArchT-GFP) auf den BF und die Faseroptik über den LHb gerichtet haben von vGlut2-Cre+/−-Tieren, um vGlut2BF→LHb-Terminals zu hemmen. Elektrophysiologische Experimente bestätigten, dass die ArchT-gesteuerte Photoinhibition der BF-Terminals die synaptische Übertragung an LHb-Zielzellen wirksam hemmt (Supp. Abb. 9; siehe Methoden). Bei der Durchführung von In-vivo-Verhaltenstests führte die optogenetische Hemmung der vGlut2BF→LHb-Terminals weder zu einem Phänotyp der Ortspräferenz in Echtzeit, noch hatte sie einen Einfluss auf die Nahrungsaufnahme in einem Wiederfütterungstest (Supp. Abb. 10 und 11). Aufgrund der Redundanz der Fress- und Abneigungsschaltkreise im Gehirn27 ist es wahrscheinlich, dass der vGlut2BF→LHb-Schaltkreis ausreicht, aber nicht unbedingt notwendig ist, um die richtige Nahrungsaufnahme und das aversive Verhalten zu regulieren. Nichtsdestotrotz identifizieren unsere Daten eindeutig einen Aversionsschaltkreis, der in der Lage ist, den Triebfress schnell und reflexartig außer Kraft zu setzen.

In dieser Studie haben wir festgestellt, dass vGlut2BF-Neuronen stark zum LHb projizieren, einem prominenten Abneigungszentrum des Gehirns. Mithilfe von Faserphotometrie und Kalziumbildgebung in vivo haben wir herausgefunden, dass der vGlut2BF→LHb-Schaltkreis auf verschiedene sensorische Informationen reagiert, einschließlich aversiver und nahrungsmittelbezogener sensorischer Hinweise. Mithilfe der Optogenetik haben wir beobachtet, dass vGlut2BF→LHb-Projektionen eine starke Abneigung hervorrufen und den Nahrungskonsum außer Kraft setzen, ohne den Appetit zu beeinträchtigen. Diese Abneigung wurde nach der Konditionierung nicht erinnert und löste auch keine Stress- oder Kampf-oder-Flucht-Reaktion aus. Die Aktivierung des vGlut2BF→LHb-Schaltkreises beeinträchtigte auch die Gedächtnisbildung. Daher wirkt dieser BF-zu-LHb-Aversionsschaltkreis reflexartig augenblicklich (Abb. 7).

Grafische Zusammenfassung. Riechsinnliche Informationen werden über den glutamatergen BF-Schaltkreis an das LHb weitergeleitet, um aversives Verhalten auszulösen und appetitanregendes Verhalten wie das Füttern außer Kraft zu setzen.

Das basale Vorderhirn ist ein Knoten mit verschiedenen Funktionen, einschließlich sensorischer Verarbeitung, Aufmerksamkeit, Motivation, Lernen und Gedächtnis18,25,28,29,30,31,32,33,34,35. Zuvor haben wir und andere unabhängig voneinander herausgefunden, dass der BF eine Rolle bei der Appetitunterdrückung und aversiven Verhaltensweisen spielt12,13,14,26. Eine Möglichkeit, wie der BF unterschiedliche Verhaltensweisen hervorrufen kann, sind seine unterschiedlichen Projektionen. Zu den Zielen des BF gehören sensorische Regionen wie der piriforme Kortex, mit der Nahrungsaufnahme verbundene Regionen wie der Hypothalamus und mit Belohnung/Abneigung verbundene Regionen wie die basolaterale Amygdala, der ventrale tegmentale Bereich und die laterale Habenula12,13,26. Während sich diese Studie auf die Rolle von BF-Projektionen auf das LHb bei Abneigung und Nahrungsaufnahme konzentrierte, haben frühere Studien gezeigt, dass BF-Projektionen auf das LHA auch Abneigung und Hypophagie hervorrufen12. Das LHA ist ein besonders interessantes Ziel des BF, da bekannt ist, dass vGlut2LHA-Neuronen auch unabhängig voneinander Abneigung und Appetitunterdrückung steuern10. Allerdings rekapituliert die Terminalfeldaktivierung von vGlut2BF→LHA-Projektionen die durch BF-Zellkörper induzierte Abneigung nicht vollständig. Dies weist darauf hin, dass andere nachgeschaltete Knoten – wie der LHb – möglicherweise mit dem LHA zusammenarbeiten, um solche Verhaltensweisen zu modulieren.

Es ist bekannt, dass das LHb an Abneigungs- und Fluchtverhalten beteiligt ist, durch Stress und Bestrafung sowie durch Bestrafung vorhersagende Sinnesreize aktiviert wird und insgesamt einen aversiven Zustand hervorruft, indem es sowohl die Motivation als auch die belohnungsgetriebene mesolimbische dopaminerge und dorsale Raphe hemmt serotonerge Systeme15,36,37,38,39,40,41,42. Im Hinblick auf die Nahrungsaufnahme hemmen LHA-Projektionen auf das LHb die hedonische Nahrungsaufnahme und führen zu aversivem Verhalten9. Somit dient das LHb als Hauptkandidat für die Konvergenz von Aversion und Fütterungsschaltkreisen. Wir fanden heraus, dass die Aktivierung von vGlut2BF-Projektionen auf das LHb den Esstrieb unterdrückt und in Echtzeit eine Abneigung gegen Orte hervorruft. Zahlreiche andere Reize der lateralen Habenula führen bei Stimulation zu einer Abneigung, darunter der laterale präoptische Bereich, das ventrale Pallidum, das mediale Septum und der laterale Hypothalamus9,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52. Es gab auch Berichte über reziproke Projektionen vom LHb zum LHA36. Die wechselseitige Konnektivität zwischen diesen beiden Knoten kann verschiedene Abneigungszentren im Gehirn synchronisieren, um eine schnelle und schnelle Verhaltensreaktion auf bedrohliche oder schlecht angepasste Reize sicherzustellen. Da der BF stromaufwärts liegt und sowohl mit LHb als auch mit LHA funktionell verbunden ist, könnte der BF eine weitere synergistische Kontrolle der Aversion ermöglichen und diese Synchronisierung erleichtern. Somit stellt die Interkonnektivität von BF, LHA und LHb einen interessanten Drei-Knoten-Schaltkreis dar, durch den aversive und appetitliche Informationen synchronisiert werden, um schnelle Änderungen im Verhaltenszustand herbeizuführen. Es ist wichtig anzumerken, dass die meisten Manipulationen in dieser Studie optogenetische Gain-of-Function-Experimente mit Channelrhodopsin zur Aktivierung von BF-Axon-Terminals beinhalteten. Ein potenzieller Nachteil dieser Experimentiermethode ist die Möglichkeit der Rückausbreitung von Aktionspotentialen. Allerdings unterscheiden sich die zuvor beobachteten hypophagischen Phänotypen der optogenetischen BF-Stimulation12 von den in dieser Studie beobachteten breiteren Aversionsphänotypen, was darauf hindeutet, dass dies in unseren Experimenten wahrscheinlich nicht der Fall ist. Auch die Unfähigkeit, die Nahrungsaufnahme zu fördern und/oder die Aversion durch terminale Feldhemmung innerhalb des LHb durch gezielte Archaerhodopsin-Stimulation zu unterdrücken, beweist nicht definitiv eine echte Manipulation des Funktionsverlusts. Dies kann daran liegen, dass dieser Schaltungsknoten allein nicht in der Lage ist, solche Verhaltensweisen zu kontrollieren, oder es kann auch als technische Hürde angesehen werden, die Kommunikation an diesem Knoten mit diesem Ansatz effektiv zum Schweigen zu bringen.

Der BF spielt eine wichtige Rolle bei der sensorischen Verarbeitung und Integration und reagiert nachweislich auf aversive und appetitliche sensorische Reize12,17,18,30,31,32,34. Mithilfe genetisch kodierter Kalziumindikatoren und Faserphotometrie beobachteten wir, dass vGlut2BF→LHb-Projektionen sowie LHb-Zellen, die BF-Input erhalten, auf verschiedene sensorische Reize reagieren. Es wurde bereits gezeigt, dass das LHb durch verschiedene Arten von Sinnesreizen aktiviert wird, darunter aversive Reize und aversive prädiktive Reize sowie belohnende Reize41,44,53,54,55. Daher ist ein Weg, der verschiedene sensorische Informationen an das LHb weiterleitet, wahrscheinlich über den BF.

Verschiedene sensorische Reize aktivieren sowohl vGlut2BF→LHb-Axonterminals als auch LHb-Zellen, die BF-Input erhalten. Bemerkenswert ist, dass die zellulären LHb-Reaktionen viel schärfer und stärker waren als die terminalen BF-Reaktionen. Dies kann ein technischer Aspekt sein, der auf Unterschiede im Signal-Rausch-Verhältnis bei der Aufnahme von Soma- und Axonterminals zurückzuführen ist, oder es kann auf physiologische Unterschiede hinweisen. Beispielsweise reagieren BF-Terminals möglicherweise weniger synchronisiert auf sensorische Signale, was die Geruchsreaktion verlängert, während LHb-Zellen möglicherweise gleichmäßiger und schneller reagieren. Eine entscheidende Frage ist, ob es dieselben oder unterschiedliche BF/LHb-Populationen sind, die auf aversive bzw. appetitliche Sinnesreize reagieren. Wenn nur summierte Bevölkerungsreaktionen mittels Faserphotometrie gemessen werden, ist es schwierig, diese Frage zu beantworten. Beide Knoten bestehen aus heterogenen Zelltypen und unterschiedliche Subpopulationen können auf belohnende und aversive Reize reagieren53,56. Wenn man jedoch bedenkt, dass diese Knoten auch auf neutrale Gerüche reagieren, ist es auch möglich, dass dieser Schaltkreis breit oder nicht selektiv auf sensorische Informationen reagiert. Es ist möglich, dass der vGlut2BF→LHb-Schaltkreis sowohl durch lebensmittelbedingte als auch durch aversive Gerüche aktiviert wird, da er die Abneigung und die Unterdrückung der Nahrungsaufnahme unabhängig voneinander über unterschiedliche Mechanismen moduliert. Ebenso könnte die Reaktion auf neutrale Gerüche darauf hinweisen, dass BF-Projektionen eine Rolle bei der Weiterleitung wichtiger sensorischer Informationen an Belohnungs- und Abneigungszentren spielen. Daher wird es von entscheidender Bedeutung sein, festzustellen, ob vGlut2BF→LHb-Projektionen funktionell unterschiedliche Ensembles enthalten, die auf appetitliche bzw. aversive Signale reagieren. Oder wenn vGlut2BF→LHb-Projektionen weitgehend auf sensorische Informationen reagieren, ist es wichtig zu bestimmen, welche anderen Gehirnregionen diesen sensorischen Informationen Valenz zuweisen – zum Beispiel durch zusätzliche nachgeschaltete Ziele des BF oder durch andere Eingaben in das LHb.

Aversive Reize bilden normalerweise Assoziationen mit verschiedenen sensorischen und kontextuellen Hinweisen. Darüber hinaus ist zu erwarten, dass solche drastischen aversiven Verhaltensweisen eine Stressreaktion auslösen. Die Unfähigkeit der vGlut2BF→LHb-Aversion, mit kontextuellen Hinweisen in Verbindung gebracht zu werden oder eine hormonelle Stressreaktion auszulösen, ist daher etwas überraschend. Unabhängige Studien haben jedoch gezeigt, dass die durch BF-Zellkörper hervorgerufene Aversion auch keine konditionierte Ortspräferenz auslöst26, was darauf hindeutet, dass die durch BF bedingte Aversion offenbar nicht erinnert wird. Noch überraschender ist, dass die optogenetische Stimulation des vGlut2BF→LHb-Schaltkreises nach einem neuartigen Objekterkennungstraining die Objektunterscheidung vollständig beeinträchtigte, was darauf hindeutet, dass der vGlut2BF→LHb-Schaltkreis die Gedächtnisbildung aktiv hemmt. Dies ist zwar provokativ, wirft aber die Frage auf, was der evolutionäre Zweck eines Schaltkreises wäre, der sofortige Abneigung hervorruft und die Gedächtniskonsolidierung beeinträchtigt. Möglicherweise beruht die reflexive, augenblickliche Natur der vGlut2BF→LHb-getriebenen Abneigung auf der Fähigkeit dieses Schaltkreises, alle Verhaltens- und kognitiven Funktionen zu stören und eine sofortige aversive Reaktion zu ermöglichen. Fehlt diese Signalisierung, können kognitive Funktionen wie Lernen und Gedächtnis oder motivierte Verhaltensweisen wie das Füttern auftreten. Andere Studien haben auch darauf hingewiesen, dass entweder die Aktivierung oder Hemmung des LHb die kontextuelle Konditionierung beeinträchtigt57, sodass möglicherweise jede Störung der LHb-Signalisierung ausreicht, um Lernen und Gedächtnis zu beeinträchtigen. Diese Auswirkungen auf das Gedächtnis stimmen mit unseren Beobachtungen überein, dass ChR2-exprimierende Mäuse während Echtzeit-Ortsvermeidungstests kontinuierlich in eine Photostimulationszone zurückkehren und trotz der hervorgerufenen Abneigung die gleiche Anzahl von Fahrten durchführen wie GFP-Kontrollen. Eine mögliche Interpretation dieser Daten ist, dass die Aktivierung des vGlut2BF→LHb-Schaltkreises die Impulsivität erhöht, was Mäuse lernunfähig macht und dazu führt, dass sie wiederholt in eine aversive Zone geraten. Da schließlich ChR2-exprimierende Mäuse unmittelbar nach der optogenetischen Stimulation ihre normale Nahrungsaufnahme wieder aufnehmen, scheint die Aktivierung des vGlut2BF→LHb-Schaltkreises das Tier offenbar nicht zu stressen, da akut gestresste Tiere ihren Appetit verlieren58. Zusammengenommen deuten die Lern- und Gedächtnistests sowie die Hormondaten darauf hin, dass der vGlut2BF→LHb-Schaltkreis eine reflexive Abneigung auslöst, die sich von anderen aversiven Verhaltensweisen unterscheidet.

Wenn optogenetische vGlut2BF→LHb-Mäuse aufgefordert werden, in einem Bereich mit aversiver Photostimulation Nahrung zu sich zu nehmen, passen sie ihre Verhaltensstrategie an, um kurze, aber häufige Ausflüge zu einer Nahrungszone zu machen, damit sie in kurzer Zeit so viel Nahrung wie möglich konsumieren können, was zu einer ähnlichen Nahrung führt Aufnahmemengen als Kontrollen. Da die kumulative Nahrungsaufnahme nicht beeinflusst wird, deutet dies darauf hin, dass die Aktivierung des vGlut2BF→LHb-Schaltkreises die Nahrungsaufnahme hemmt, ohne den Appetit oder die gesamte Nahrungsaufnahme zu beeinträchtigen. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zur offensichtlichen Unterdrückung der Nahrungsaufnahme, wenn Mäuse in der gesamten Arena kontinuierlich stimuliert werden (wie in Abb. 3c). Eine Erklärung für diese gegensätzlichen Ergebnisse ist, dass Mäuse, wenn sie nur in einer bestimmten Zone einer Arena stimuliert werden, in kurzen Phasen ein Fressverhalten einleiten und in eine nicht stimulierte Zone flüchten können, sobald die aversive Photostimulation maximal aktiviert ist. Andererseits beginnen Mäuse bei kontinuierlicher Photostimulation nie mit der Nahrungsaufnahme und nehmen daher im Vergleich zu GFP-Kontrollen weniger Nahrung auf. Diese Daten stützen die Interpretation, dass der vGlut2BF→LHb-Schaltkreis in erster Linie einen aversiven Phänotyp auslöst, der das Fressverhalten außer Kraft setzt, ohne den Appetit zu beeinträchtigen. Die Unterdrückung der Nahrungsaufnahme ist daher zweitrangig gegenüber aversivem Verhalten. Eine alternative Interpretation ist jedoch, dass der vGlut2BF→LHb-Schaltkreis unterschiedliche Funktionen sowohl bei der Unterdrückung als auch der Aversion der Nahrungsaufnahme hat. Diese alternative Interpretation wird durch Faserphotometriedaten gestützt, die Geruchsreaktionen sowohl auf ernährungsbedingte als auch auf aversive Reize offenbaren, sowie durch Daten, die das Fehlen einer hormonellen Stressreaktion nach optogenetischer Stimulation belegen, da viele Abneigungsschaltkreise Kampf oder Flucht auslösen Stresshormonausschüttung. Möglicherweise werden Nahrungsunterdrückung und -aversion normalerweise anhand unterschiedlicher Feuerungsraten, der Stärke der neuronalen Reaktion oder der Rekrutierung verschiedener neuronaler Ensembles auseinandergehalten. Allerdings kann die künstliche Natur der optogenetischen Stimulation, bei der die gesamte BF→LHb-Population mit einer bestimmten Frequenz feuert, die physiologische vGlut2BF→LHb-Signalisierung maskieren. Nichtsdestotrotz deuten diese Daten darauf hin, dass der vGlut2BF→LHb-Schaltkreis ausreicht, um sowohl eine starke reflexive Abneigung als auch eine drastische Unterdrückung der Nahrungsaufnahme auszulösen.

Zusammenfassend haben wir einen basalen Schaltkreis im Vorderhirn identifiziert und untersucht, der eine starke, reflexive Abneigung auslöst, die das Essverhalten außer Kraft setzt. Die reflexive Natur dieser Abneigung ist einzigartig und verändert unser Verständnis davon, wie Abneigungsschaltkreise mit motivierten Verhaltensweisen konkurrieren, um schnelle Reaktionen auf von Natur aus aversive Reize hervorzurufen. Darüber hinaus liefert diese Studie wichtige Erkenntnisse darüber, wie Abneigung/Belohnung und sensorische Verarbeitung mit homöostatischen Schaltkreisen interagieren, um das Fütterungsverhalten und das Körpergewicht zu verändern. Aus evolutionärer Sicht müssen motivierte, überlebenswichtige Verhaltensweisen wie Nahrungssuche, Nahrungsaufnahme und Fortpflanzung durch Vorsicht gegenüber neuen und/oder fremden Umgebungen und ein Bewusstsein für Umwelthinweise, die auf Belohnung oder Gefahr hinweisen, ausgeglichen werden. Daher müssen zahlreiche Abneigungs- und Fluchtschaltkreise im Gehirn so verdrahtet werden, dass sie bei Bedarf die Fütterungsschaltkreise außer Kraft setzen, wenn eine Bedrohung vorliegt. Indem wir untersuchen, wie diese Schaltkreise funktionieren und anatomisch miteinander verbunden sind, können wir verheerende Erkrankungen wie Fettleibigkeit und Essstörungen, die erhebliche direkte Auswirkungen auf die Gesundheit haben, sowie zahlreiche andere schädliche Nebenwirkungen besser verstehen und behandeln59,60. Darüber hinaus kann das Verständnis des Einflusses der BF-Schaltkreise auf diesen Abneigungsknoten aufgrund der Beteiligung des LHb an Sucht, Stimmungsstörungen und Schizophrenie15,61 möglicherweise zu unserem Verständnis anderer Arten von psychischen Erkrankungen beitragen.

Mäuse:

vGlut2-Cre (Slc17a6tm2(cre)Lowl)

Quelle: Jackson-Labor

Stammnummer: 016963

Wildtyp C57BL/6NJ

Quelle: Jackson-Labor

Stammnummer: 005304

AAVs:

Cre-abhängiges Synaptophysin: AAV-Ef1α-flex-Synaptophysin::mRuby2-WPRE-hGHpA

Serotyp: DJ8

Quelle: Neuroconnectivity Core am Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute

Cre-abhängiges ChR2: AAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA

Serotyp: 2/9

Quelle: Neuroconnectivity Core am Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute; Plasmid, subkloniert von Addgene #26973

Cre-abhängiges mRuby: AAV-Ef1α-flex-mRuby2

Serotyp: DJ8

Quelle: Neuroconnectivity Core am Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute; Plasmid subkloniert aus Addgene #40260

Cre-abhängiges GFP: AAV-Ef1α-flex-eGFP

Serotyp: DJ8

Quelle: Neuroconnectivity Core am Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute; Plasmid subkloniert aus Addgene #28304

Cre-abhängiges GcaMP: AAV-Syn-flex-GcaMP8s-WPRE-hGHpA

Serotyp: DJ8.

Quelle: Neuroconnectivity Core am Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute; Plasmid von Addgene #10083962

AAV1-Cre: AAV1-hSyn-Cre-WPRE-pA

Serotyp: 2/1 (anterograd)

Quelle: Addgene #105553 (U Penn Viral Core)

Cre-abhängiges ArchT: AAV-CAG-flex-ArchT-GFP

Serotyp: 2/9

Quelle: Neuroconnectivity Core am Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute; Plasmid von Adddgene #28307 aus Edward Boydens Labor63

Die in dieser Studie verwendeten Mäuse wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften des US-Gesundheitsministeriums und des IACUC behandelt. Alle Versuchsprotokolle wurden vom Baylor College of Medicine und dem lizenzierten BCM IACUC-Protokollgenehmigungsausschuss unter der Protokollnummer AN5596 genehmigt. Alle Methoden wurden gemäß den Empfehlungen in den ARRIVE-Richtlinien gemeldet. Für alle Experimente wurden sowohl männliche als auch weibliche Wurfgeschwister verwendet und auf Versuchs- und Kontrollgruppen verteilt. Für stereotaktische Operationen waren die Mäuse mindestens 8 Wochen alt und das Verhalten wurde an Mäusen im Alter zwischen 3 und 5 Monaten durchgeführt. Die Tiere wurden in einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus gehalten und in Gruppen gehalten. Mäuse wurden mit Standard-Mäusefutter (Harlan, 2920X) gefüttert und dieses Futter oder Futter mit hohem Fettgehalt (60 % kcal Fett, Research Diets Inc 12492) wurde für Fütterungsexperimente verwendet. vGlut2-Cre-Mäuse (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J Stock No. 01696364) wurden von Jackson Laboratories gekauft. Die Genotypisierung für vGlut2-Cre wurde unter Verwendung der folgenden Primer von Jackson Laboratories durchgeführt: Mutant Reverse „ACA CCG GCC TTA TTC CAA G“ (Primer 13007), Common „AAG AAG GTG CGC AAG ACG“ (Primer 32667) und Wildtyp Reverse „ CTG CCA CAG ATT GCA CTT GA“ (Grundierung 32668). Um Heterozygoten (vGlut2-Cre+/-) zu erhalten, wurden homozygote vGlut2-Cre-Mäuse (vGlut2-Cre+/+) mit C57BL/6NJ-Wildtyp-Mäusen (Jackson Labs Stock No. 005304) gekreuzt.

Bei allen stereotaktischen Operationen wurden die Mäuse anästhesiert und unter Narkose gehalten, wobei etwa 1–3 % verdampftes Isofluran mit Sauerstoff verwendet wurde. Ein mit der Angle Two-Software verbundenes stereotaktisches Instrument wurde verwendet, um Regionen des Gehirns genau anzuvisieren. Nach der Nivellierung des Schädels sowohl in ML- als auch in AP-Richtung (innerhalb von +/− 0,03 mm) wurden verschiedene Regionen mithilfe empirisch ermittelter Koordinaten anvisiert. Die AP-Koordinate wurde leicht nach vorne verschoben, um die Neigung des Gehirns auszugleichen, und optimierte Koordinaten wurden vor jedem stereotaktischen chirurgischen Experiment mithilfe von diI-Injektionen überprüft. Zu diesem Zweck wurde das basale Vorderhirn durch bilaterale Injektionen von Bregma anvisiert, AP = 1,18 mm, DV = − 5,8 mm und ML = ± 1,29 mm. Für alle Experimente wurden 150 nL Virus pro Seite verwendet und das Virus wurde in den medialen basalen Vorderhirnregionen von Bregma 0,97 bis Bregma 0,50 konzentriert. Für anatomische Verfolgungsexperimente wurde AAV-Ef1α-flex-Synaptophysin::mRuby2-WPRE-hGHpA (Serotyp DJ8) verwendet. Für die Channelrhodopsin-unterstützte Schaltkreiskartierung wurde AAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA (Serotyp 2/9) für die lichtunterstützte Aktivierung und AAV-Ef1α-flex-mRuby2 (Serotyp DJ8) für die lichtunterstützte Aktivierung verwendet Wird zum Beschriften von Zellen verwendet, aus denen aufgezeichnet werden soll. Zur elektrophysiologischen Validierung von ArchT-GFP wurde AAV-CAG-flex-ArchT-GFP (Serotyp 2/9) mit AAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA (Serotyp 2/9) gemischt Volumenverhältnis 1:1. Für optogenetische Verhaltenstests wurde AAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA (Serotyp 2/9) für Gain-of-Function-Versuchstiere und AAV-Ef1α-flex-eGFP (Serotyp DJ8) verwendet für Kontrollen und AAV-CAG-flex-ArchT-GFP (Serotyp 2/9) wurde für Funktionsverlustexperimente verwendet. Für Calcium-Imaging-Experimente wurden AAV-Synapsin-flex-jGCaMP8s-WPRE-pA (Serotyp DJ8) und/oder AAV1-hSyn-Cre-WPRE-pA (Serotyp 2/123) verwendet. Der Titer aller Viren betrug mindestens 1011 Viruspartikel/µL.

Mindestens zwei Wochen nach der Virusinjektion wurden die Mäuse mit Isofluran anästhesiert und mit PBS, gefolgt von 4 % PFA (verdünnt mit 16 % Paraformaldehyd EM Grade Nr. 15710 Electron Microscopy Sciences) transkardial perfundiert. Die Gehirne wurden herauspräpariert und in 4 % PFA über Nacht bei 4 °C weiter tropfenfixiert, gefolgt von einer Kryoprotektion über Nacht in 20 % Saccharose in PBS und schließlich über Nacht in 30 % Saccharose in PBS bei 4 °C. Kryogeschützte Gehirne wurden dann in OCT (Fisher HealthCare Nr. 4585) eingebettet und eingefroren und bis zum Schneiden bei –80 ° C gelagert. Gehirne wurden koronal von vorne nach hinten auf einem Kryostat (Leica CM1860) bei 40 μm für Virusverfolgungs-/-markierungsexperimente und bei 80 μm zur post-hoc-Bestimmung der Glasfaserimplantationsstellen geschnitten. Beim Schneiden mit 40 μm wurde jeder dritte Abschnitt gesammelt. Beim Schneiden mit 80 μm wurde jeder Abschnitt gesammelt. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Schnitte auf Objektträger montiert und mit DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech, 0100–20) gefärbt. Die Bilder wurden entweder mit einem konfokalen Leica TCS SPE-Mikroskop mit 10- oder 20-facher Vergrößerung, einem Leica TCS SP8 STED-Mikroskop oder einem Leica SP8X-Mikroskop aufgenommen. Alle gekachelten Bilder wurden mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen. Zur Quantifizierung der BF-Synaptophysin::mRuby2-Markierung wurden drei Tiere im gesamten Gehirn analysiert, vom Riechkolben bis zum Kleinhirn. In Regionen, in denen eine Synaptophysin::mRuby2-Markierung beobachtet wurde, wurden drei Bilder pro Region (identifiziert mit dem Allen Brain Atlas) über verschiedene Schnitte innerhalb eines Tieres aufgenommen. Das Fluoreszenzsignal wurde nachträglich mit Imaris quantifiziert, wobei Masken über Regionen von Interesse (ROIs) gezogen und das Hintergrundsignal subtrahiert wurden, um ein Volumen der Synaptophysin::mRuby2-Terminals dividiert durch das Gesamtvolumen des ROI zu berechnen. Technische Replikate innerhalb eines Tieres wurden dann gemittelt, um einen biologischen Replikatdurchschnitt zu erstellen, der zur Berechnung einer gesamten durchschnittlichen Synaptophysin::mRuby2-Dichte über biologische Replikate hinweg verwendet wurde.

Die elektrophysiologischen Aufzeichnungsexperimente in Scheiben wurden wie zuvor beschrieben65 mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, Mäuse wurden mit Isofluran tief anästhesiert und dann transkardial mit eiskalter künstlicher Liquorlösung (aCSF) perfundiert, die (in mM) enthielt: 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 25 Glucose und 25 Bicarbonat (pH 7,3, 295 mOsM). Die Gehirne wurden entnommen und in eine eiskalte Schneidlösung überführt, die (in mM) enthielt: 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 10 MgSO4, 0,5 CaCl2, 234 Saccharose, 11 Glucose und 26 Bicarbonat. Die Schneidlösung wurde kontinuierlich mit 95 % CO2/5 % O2 durchperlt. Die Gehirne wurden koronal in 1,5 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt eingebettet. In Agar eingebettete Gehirne wurden sofort auf einem Leica VT1200-Vibratom in sauerstoffhaltige Schneidlösung getaucht. Mit einer Schnittgeschwindigkeit von 0,4 mm/s wurden koronale Schnitte von 300 Mikrometern angefertigt. Die Scheiben wurden für mindestens 30 Minuten bei 37 °C in eine Scheibenrückgewinnungskammer mit sauerstoffhaltigem aCSF gebracht. Nach der Erholung wurden die Schnitte vor der Aufzeichnung 30 Minuten lang langsam wieder auf Raumtemperatur gebracht.

Für die Kartierung des optogenetischen Schaltkreises der glutamatergen Eingaben des basalen Vorderhirns in das LHb wurden vGlut2+-LHb-Zellen durch mRuby2-Markierung identifiziert und gepatcht. Gepatchte Zellen wurden zunächst einer Spannung von –65 mV ausgesetzt, um die grundlegenden Membraneigenschaften aufzuzeichnen. Um das Vorhandensein eines durch Licht hervorgerufenen Einwärtsstroms zu überprüfen, wurde Channelrhodopsin durch Vollfeldbeleuchtung von einer gefilterten Xenonlichtquelle aktiviert, die nach (Olympus, U-N41020) gefiltert wurde. Der Beginn und die Dauer der Lichtstimulation wurden über die ClampEx-Software (Version 10.3) durch einen mechanischen Verschluss (Sutter) gesteuert. Anschließend wurden die gepatchten Zellen mit einer Spannung von 0 mV (angepasst an das Übergangspotential) beaufschlagt, um nach außen gerichtete Ströme sichtbar zu machen. Wenn in aCSF ein durch Licht hervorgerufener Auswärtsstrom beobachtet wurde, wurden TTX (1 µM), 4AP (0,5 µM) und CNQX (10 µM / APV (50 µM) nacheinander im Bad aufgetragen, um Folgendes zu überprüfen: (1) das Aktionspotential -Abhängigkeit; (2) die monosynaptische Natur; und (3) die Glutamatrezeptor-Abhängigkeit des hervorgerufenen Stroms.

Um unsere Fähigkeit zu validieren, den vGlut2BF→LHb-Schaltkreis durch ArchT-Stimulation zu hemmen, injizierten wir eine 1:1-Volumenmischung aus AAV-CAG-flex-ArchT-GFP und AAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA zum BF, und Ganzzell-Voltage-Clamp-Aufzeichnungen wurden von Zellen im LHb gemäß den oben genannten Spezifikationen durchgeführt. Nachdem wir diejenigen identifiziert hatten, die auf die präsynaptische Stimulation von ChR2 in BF-Terminals unter Verwendung von 470-nm-Licht reagierten, testeten wir anschließend, ob die ArchT-Hemmung das durch ChR2 hervorgerufene Feuern unterdrückte. Zu diesem Zweck wurde über einen längeren Zeitraum hinweg kontinuierlich Licht mit einer Wellenlänge von 565 nm abgegeben. Anschließend wurde ChR2 während der ArchT-Photoinhibition nacheinander stimuliert (470-nm-Licht), um zu testen, ob ArchT das durch ChR2 hervorgerufene Feuern unterdrückte. Schließlich wurde die ArchT-Stimulation beendet und die ChR2-Stimulation verwendet, um die postsynaptische LHb-Zelle reversibel zu reaktivieren.

Für BF-Axon-Terminal-Calcium-Bildgebungsexperimente wurde männlichen und weiblichen vGlut2-Cre+/−-Wurfgeschwistern unter Verwendung der oben beschriebenen Koordinaten bilateral rAAV-Syn-flex-GCaMP8s-WPRE-hGHpA62 in den HDB injiziert. Für die Kalziumbildgebung des LHb-Zellkörpers wurde rAAV1-hSyn-Cre-WPRE-pA bilateral in den HDB und rAAV-Syn-flex-GcaMP8s-WPRE-hGHpA in den linken LHb injiziert. Gleichzeitig mit der Virusinjektion wurde ein Glasfaserimplantat (200-um-Kern mit NA = 0,50, RWD R-FOC-L200C-50NA) über dem linken LHb unter Verwendung der Koordinaten von Bregma AP = − 1,45, ML = − 0,45 und befestigt DV = − 2,60 unter Verwendung des gleichen Prozesses wie oben. Zusätzlich wurde am hinteren Teil des Schädels eine Kopfplatte aus Aluminium zementiert, die es Mäusen ermöglichte, den Kopf während der Geruchspräsentation auf einem Laufrad zu fixieren. Den Mäusen wurde erlaubt, das Virus drei Wochen lang zu heilen und zu exprimieren, bevor die faserphotometrischen Aufzeichnungen erfolgten.

Während der faserphotometrischen Aufzeichnungen wurde der Kopf der Mäuse auf einem Laufrad fixiert, wobei ein Olfaktometer22 etwa 6 cm von ihrer Nase entfernt positioniert war. Zu den präsentierten Geruchsstoffen gehörten Fuchsurin (Predator Pee), Futter (5V5-Futter zerkleinert und in Mineralöl gelöst), Methylbutylamin (Sigma 241407), Cadaverin (Sigma 52063), Buttersäure (Sigma B103500), R(+)-Limonen (Sigma 183164), S(-)-Limonene (Sigma 218367), Rosenöl (Rainbow Abby) und Erdnussbutter (Justin's). Alle Gerüche wurden in Mineralien mit einer Konzentration von 2 Vol.-% gelöst und in 10er-Replikaten in zufälliger Reihenfolge präsentiert. Als Negativkontrolle wurde ausschließlich Mineralöl verwendet. Alle Gerüche waren neu, mit Ausnahme des 5V5-Chow-Geruchsstoffs.

Faserphotometrische Aufzeichnungen wurden mit dem Doric-System durchgeführt, wie in66 beschrieben. Kurz gesagt, zwei Leuchtdioden (465 und 405 nm Wellenlänge) wurden über Glasfaserkabel (400 um Kern, NA = 0,48) an einen Filterwürfel gekoppelt. Der Filterwürfel trennte Anregungs- und Emissionswellenlängen und leitete die Anregungswellenlängen entlang einer anderen Faseroptik (200-um-Kern, NA = 0,48), die über eine Ferrulenhülse mit der implantierten Faseroptik der Maus verbunden war. Emissionswellenlängen wurden von der Maus über dieselbe Faser zum Filterwürfel übertragen und dann über ein Glasfaserkabel (600 um-Kern, NA = 0,48) zu einem Femtowatt-Fotodetektor (Newport) geleitet. Anregung und Emission wurden in der Doric Studio-Software gesteuert bzw. aufgezeichnet. jGCaMP8s wurde bei 465 nm angeregt, um die Kalziumdynamik aufzuzeichnen, die auf neuronale Aktivität hinweist. Gleichzeitig sammelten wir bei 405 nm, dem isosbestischen Punkt für GCaMP, Emissionen, die unempfindlich gegenüber der Kalziumbindung waren. Dies wurde zur Kontrolle von Bewegungsartefakten und anderen kalziumunabhängigen Geräuschen verwendet. Um gleichzeitig vom Kontrollkanal (405 nm) und vom experimentellen Kanal (465 nm) aufzunehmen, verwendeten wir eine „Locked-in“-Strategie, bei der jede LED mit einer anderen Hochfrequenz (typischerweise 270 bzw. 500 Hz) moduliert wurde. Die aus beiden Anregungsmodi resultierende Emission wurde von demselben Fotodetektor aufgezeichnet und das Signal online in Doric Studio demoduliert, um den Kontrollkanal vom experimentellen Kanal zu trennen. Beide Signale wurden dann in Doric Studio mit ihrem Analysetool in dF/F umgewandelt, wobei der Kontrollkanal vom experimentellen Kanal subtrahiert wurde, um das Rauschen zu reduzieren. Der Z-bewertete dF/F wurde für die 5 Sekunden vor und 20 Sekunden nach jeder Geruchspräsentation berechnet. Gerüche wurden 2 Sekunden lang präsentiert, gefolgt von einem 18-sekündigen Intervall zwischen den Versuchen. Heatmaps wurden in MATLAB (Version R2019a) erstellt. Von Arduino erzeugte TTL-Impulse lösten das Olfaktometer aus und wurden während der Aufzeichnung als digitaler Eingang verwendet, um die Aufzeichnung der Faserphotometrie präzise auf die Geruchspräsentation abzustimmen. Nachdem der Durchschnitt von 10 technischen Replikaten für jede einzelne Maus ermittelt worden war, wurden die biologischen Replikate zusammen gemittelt, um einen zusammengesetzten Durchschnitt zu erstellen. Die durchschnittliche Z-Score-Reaktion wurde für 3 s vor (Grundlinie) und 3 s nach der Geruchsabgabe berechnet. Anschließend wurden die durchschnittlichen Grundreaktionen von der Geruchsreaktion abgezogen, um eine grundliniennormalisierte Geruchsreaktion für alle Gerüche zu erzeugen. Die statistische Signifikanz wurde dann mithilfe eines T-Tests mit einer Stichprobe berechnet, bei dem normalisierte Geruchsreaktionen mit 0 (der Nullhypothese) verglichen wurden.

Für optogenetische Implantate wurden acht Wochen alte vGlut2-Cre+/−-Mäuse stereotaktisch bilateral in den BF mit rAAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA (Serotyp 2/9), rAAV-Ef1α-flex- GFP (Serotyp DJ8) oder rAAV-CAG-flex-ArchT-GFP (Serotyp 2/9). Eine Woche später wurden Mäusen bilateral über dem LHb maßgeschneiderte Glasfaserimplantate implantiert, wie in Patel und Swanson 201967 beschrieben. Kurz gesagt wurde ein 200-um-Kern-Glasfaserkabel (0,22 NA, FG200AEA) abgezogen und in einer 230-um-Ferrule befestigt (Thor Labs CFLC2301-10) unter Verwendung von UV-lichtgehärtetem Epoxidharz (Bondic). Das Implantat wurde auf 3,5 mm gekürzt und das flache Ende des Implantats poliert, um eine hohe Lichtleistung (mindestens 1 mW) sicherzustellen. Die laterale Habenula wurde bilateral in einem Winkel von 15 Grad bei den Koordinaten von Bregma AP = − 1,58, ML = ± 0,34 und DV = − 2,85 implantiert. Glasfaserimplantate wurden mit Zement (C und B Metabond Dental Zement, Parkell) befestigt und mit vernetztem Flash-Acryl (Yates-Motloid 44115 und 44119) abgedeckt. 18-Gauge-Nadeln wurden auf eine Länge von etwa 1 Zoll gekürzt und mit Acryl über dem hinteren Teil des Schädels befestigt, um Mäuse ohne Scheuern an Patchkabeln zu befestigen. Stattdessen wurden Ringzangen verwendet, um Mäuse an Patchkabeln zu befestigen. Vor Verhaltensexperimenten durften sich die Mäuse nach der Implantation zwei Wochen lang erholen.

Männliche und weibliche vGlut2-Cre+/−-Wurfgeschwister wurden stereotaktisch mit rAAV-flex-ChR2-EYFP oder rAAV-flex-GFP in den BF injiziert und mit Glasfasern über dem LHb implantiert, um die BF-Terminals zu stimulieren. Nach einer zweiwöchigen Erholungsphase ließ man die Mäuse über Nacht fasten. Am folgenden Tag wurden die Mäuse an Patchkabel angeschlossen und konnten sich vor Beginn des Experiments 5 Minuten lang allein an eine Verhaltenskammer gewöhnen. Nach der Akklimatisierung wurde den einzelnen Mäusen Futter angeboten und sie wurden 5 Minuten lang mit einem 473-nm-Laser (Doric; Leistung mindestens 1 mW) bei 20 Hz und 5-ms-Impulsen fotostimuliert. Nach 5 Minuten wurde der Laser ausgeschaltet und das Essen gewogen. Anschließend durften die Mäuse 5 Minuten lang ohne Photostimulation Nahrung zu sich nehmen. Dies wurde noch einmal wiederholt (5 Minuten mit Photostimulation, gefolgt von 5 Minuten ohne Photostimulation) für eine Gesamtdauer von 20 Minuten, wobei die Nahrungsaufnahme alle 5 Minuten gewogen wurde. Die durchschnittliche Nahrungsaufnahme für jeden Zeitpunkt wurde berechnet und die ChR2- und GFP-Kontrollgruppen wurden mittels einer Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen verglichen.

Für ArchT-GFP-Mäuse wurde die gleiche stereotaktische Operation wie oben durchgeführt, jedoch unter Verwendung von rAAV-CAG-flex-ArchT-GFP. Nach der Genesung wurden die Mäuse über Nacht fasten gelassen, an Glasfaserkabel angeschlossen, mit Futter versorgt und durften 20 Minuten lang ohne Photostimulation Futter zu sich nehmen, um eine Grundnahrungsaufnahme zu berechnen (das Futter wurde alle 5 Minuten gewogen). In der folgenden Woche ließ man dieselben Mäuse über Nacht fasten und wurde dann mit einem 561-nm-Laser (CrystaLaser) bei 1 Hz und 900-ms-Impulsen kontinuierlich 20 Minuten lang photoinhibiert, während sie mit Futter versorgt wurden. Das Futter wurde alle 5 Minuten gewogen. Die durchschnittliche Nahrungsaufnahme für jeden Zeitpunkt wurde berechnet und die Gruppen „keine Stimulation“ und „Stimulation“ wurden mittels einer Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen verglichen.

Männliche und weibliche vGlut2-Cre+/−-Wurfgeschwister wurden stereotaktisch mit rAAV-flex-ChR2-EYFP, rAAV-flex-GFP oder rAAV-CAG-flex-ArchT-GFP in den BF injiziert und zur Stimulation mit Glasfasern über dem LHb implantiert BF-Terminals. Nach zweiwöchiger Genesung wurden die Mäuse an Patchkabel angeschlossen und in eine große rechteckige Arena (25 x 17 Zoll) gestellt. Den Mäusen wurde erlaubt, sich 5 Minuten lang zu akklimatisieren, und dann begann der Test. Die Bewegungen der Tiere wurden mithilfe einer Kamera verfolgt, die mit der Open-Source-Software Bonsai68 verbunden war und erkennen konnte, wann sich eine Maus in einem vorgegebenen ROI befand. Diese Software löste dann einen TTL-Impuls zur Laserphotostimulation aus (473-nm-Licht, 20 Hz, 5-ms-Impulse für ChR2-Mäuse oder 561-nm-Licht, 1 Hz, 900-ms-Impulse für ArchT-Mäuse), wenn sich die Maus in dieser Region befand. Mit dieser Software wurden Mäuse auf einer Hälfte der Arena fotostimuliert, während sie sich insgesamt 20 Minuten lang frei bewegten, während gleichzeitig Videoaufnahmen gemacht wurden. Zur konditionierten Ortspräferenz wurde dieses Paradigma drei Tage hintereinander wiederholt und am Testtag ohne Photostimulation wiederholt. Sowohl für die Echtzeit- als auch für die konditionierte Platzvermeidung wurde die in beiden Hälften der Arena verbrachte Zeit nachträglich mit der Open-Source-Software Optimouse in MATLAB69 berechnet. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe eines Binomialtests ermittelt, wobei die Nullhypothese besagte, dass Mäuse 50 % ihrer Zeit in beiden Hälften der Arena verbringen würden. Heatmaps wurden mit der Software Noldus EthoVision (XT 16) erstellt.

Die kontextuelle Angstkonditionierung wurde wie zuvor beschrieben70 mit einigen geringfügigen Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, die Mäuse wurden 3 Tage lang 3 Minuten pro Tag behandelt und dann an zwei aufeinanderfolgenden Tagen 20 Minuten lang an die Konditionierungskammer gewöhnt. Am Trainingstag wurden die Mäuse in eine Kammer mit visuellen Kontextmarkierungen an den Wänden gestellt und 2 Minuten lang akklimatisiert (naiv). Anschließend erhielten die Mäuse zwei Fußschocks im Abstand von 90 s (0,75 mA, jeweils 2 s). Eine Minute später wurden die Mäuse in ihre Heimkäfige zurückgebracht. Zwei und 24 Stunden später wurden die Mäuse für 5 Minuten wieder in die Konditionierungskammer gelegt, um das Kurzzeit- bzw. Langzeitgedächtnis zu testen. Während dieser Zeit wurde die Freeze-Reaktion (Immobilität) mithilfe von Echtzeitvideos aufgezeichnet, die von FreezeView analysiert wurden. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen und einer Sidak-Korrektur für mehrere Vergleiche gemessen.

Die Erkennung neuartiger Objekte wurde wie zuvor beschrieben71 mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt. Mäuse wurden vor dem Training drei Tage lang für 10 Minuten pro Tag an eine schwarze Kunststoffkammer (37 × 37 × 37 cm) und an optogenetische Glasfaserkabel gewöhnt. Am Trainingstag wurden die Mäuse an Glasfaserkabel angeschlossen und durften 10 Minuten lang zwei identische Objekte erkunden. Nach diesem Training wurden die Objekte entfernt und die Mäuse 10 Minuten lang bei 20 Hz (5-ms-Impulse) fotostimuliert und dann in ihren Heimkäfig zurückgebracht. 24 Stunden später (am Testtag) wurden Mäuse an Glasfaserkabel angeschlossen und ihnen 10 Minuten lang ein Objekt vom Vortag (das vertraute Objekt) und ein neuartiges Objekt von ungefähr derselben Größe (neues Objekt) präsentiert. Mit der AnyMaze-Software (Version 6.2) wurde die Zeit, die für die Untersuchung eines der beiden Objekte aufgewendet wurde, von geschulten Experimentatoren aufgezeichnet, die für die experimentelle Behandlung blind waren. Es wurde definiert, dass Mäuse ein Objekt untersuchten, wenn ihre Nase in einem Umkreis von 2 cm um das Objekt schnüffelte. Aus diesen Daten wurde ein Diskriminierungsindex berechnet, indem die Zeit, die für die Untersuchung des vertrauten Objekts aufgewendet wurde, von der des neuen Objekts abgezogen und durch die gesamte Untersuchungszeit als Prozentsatz [(Zeit für die Untersuchung eines neuen Objekts − Zeit für die Untersuchung eines vertrauten Objekts)/(Zeit für die Untersuchung eines neuen Objekts) dividiert wurde + vertrautes Objekt)] × 100. Um die Reversibilität des Photostimulationseffekts zu testen, wurde der gleiche Test eine Woche später ohne Photostimulation und mit einem anderen Satz bekannter und neuartiger Objekte durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen und einer Bonferroni-Korrektur für mehrere Vergleiche bestimmt.

Plasma für Hormonmessungen wurde zu drei Zeitpunkten gesammelt: (1) zu Beginn, bei dem die Tiere an Glasfaserkabeln befestigt wurden und sich zwei Stunden lang akklimatisieren konnten, um den Handhabungsstress auszuwaschen, dann von den Kabeln entfernt und sofort Blut gesammelt wurde. (2) Nachstimulation, bei der die Tiere an Glasfaserkabeln befestigt, 2 Stunden lang akklimatisiert, 5 Minuten lang bei 20 Hz (5-ms-Impulse) stimuliert, entfernt und sofort Blut entnommen wurden, oder (3) 20 Minuten nach der Stimulation Dabei wurden die Tiere an Kabeln befestigt, 2 Stunden lang akklimatisiert, 5 Minuten lang stimuliert (20 Hz, 5 ms Impulse), 20 Minuten lang ruhen gelassen und dann entfernt und Blut gesammelt. Diese drei Zeitpunkte wurden durch zweiwöchige Intervalle getrennt, um verfälschende Ergebnisse durch den stressigen Prozess der Blutentnahme zu vermeiden und den Tieren Zeit zu geben, sich zwischen den Blutentnahmen vom Blutverlust zu erholen. Das Plasma wurde durch Punktion der Submandibularisvene mit einer Lanzette und Auffangen des Vollbluts in EDTA-behandelten Fläschchen gesammelt. Für Katecholamine (Adrenalin und Noradrenalin) wurde eine EGTA-Glutathion-Lösung gemäß den Kernspezifikationen des Vanderbilt University Hormone Assay and Analytical Services zur Verwendung als Konservierungsmittel hergestellt. Kurz gesagt, 4,5 g EGTA und 3,0 g Glutathion wurden in 50 ml dIH20 ​​(pH 6,0–7,4) gelöst. Die EGTA-Glutathion-Lösung wurde unmittelbar nach der Blutentnahme in einer Konzentration von 1:50 in Katecholaminröhrchen gegeben. Zur Isolierung des Plasmas wurde Blut 15 Minuten lang bei 4 °C mit 14.000 g zentrifugiert. Das Plasma wurde von der obersten Schicht entfernt, schockgefroren und bei –80 °C gelagert, bis es zur Hormonanalyse an den Vanderbilt Hormone and Analytics Core geschickt wurde. Die ACTH- und Corticosteronspiegel wurden mittels Radioimmunoassays über ein Doppelantikörperverfahren und die Katecholamine Noradrenalin und Adrenalin mittels HPLC mittels elektrochemischer Detektion gemessen. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen und einer Sidak-Korrektur für mehrere Vergleiche gemessen.

Männliche und weibliche vGlut2-Cre+/−-Wurfgeschwister wurden stereotaktisch mit rAAV-flex-ChR2-EYFP oder rAAV-flex-GFP in den BF injiziert und mit Glasfasern über dem LHb implantiert, um die BF-Terminals zu stimulieren. Die Mäuse ließ man über Nacht fasten und platzierte sie in einer großen rechteckigen Arena (25 x 17 Zoll), wo sie sich 5 Minuten lang akklimatisieren konnten. Auf einer Seite einer Arena wurde Futter sicher in einer Ecke platziert, während fettreiches Futter sicher in der angrenzenden Ecke platziert wurde. Nutzung der Open Source.

Bei Bonsai68 war die Photostimulation auf einen ROI entlang der Nahrungsseite der Arena beschränkt, der gerade groß genug war, um die Maus beim Verzehr oder bei der Interaktion mit Nahrung zu fotostimulieren. Mäuse wurden per Video aufgezeichnet und die Nahrungsaufnahme wurde insgesamt 20 Minuten lang aufgezeichnet. Die durchschnittliche Nahrungsaufnahme sowohl für das Futter als auch für das Futter mit hohem Fettgehalt wurde sowohl für ChR2-EYFP- als auch für GFP-Mäuse berechnet und mithilfe der Zwei-Wege-ANOVA verglichen. Die Zeit, die auf der Stimulationsseite der Arena verbracht wurde, sowie die Zeit, die mit der Interaktion mit einer der Nahrungsmitteloptionen verbracht wurde, wurden nachträglich mit Optimouse in MATLAB69 berechnet und mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA verglichen.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Besonderer Dank geht an Dr. Joshua Ortiz-Guzman, Dr. Jennifer Selever und das Neurological Research Institute Viral Core (einschließlich Zihong Chen und Ying Wang) für die Produktion der in diesen Experimenten verwendeten AAVs. Darüber hinaus danken wir den Mitgliedern des Arenkiel-Labors für ihre Zusammenarbeit und ihre Hilfe bei der Bearbeitung dieses Manuskripts. Das beschriebene Projekt wurde durch die Multi-PI-Auszeichnungen des National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (Zuschuss Nr. R01DK109934) und des US-Verteidigungsministeriums (Zuschuss Nr. DOD W81XWH-19-1-0429) an BRA und QT, 1R01DK131446, unterstützt und R01 DK120858 an QT, R01 NS078294 und UF1NS111692 an BRA sowie die Neuroconnectivity and Neurovisualization Cores am Baylor College of Medicine, die durch IDDRC Grant Number P50 HD103555 vom Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development unterstützt werden. Das beschriebene Projekt wurde teilweise auch vom Vanderbilt Hormone and Analytics Core unterstützt, unterstützt durch die NIH-Zuschüsse DK059637 (MMPC) und DK020593 (DRTC). Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, der National Institutes of Health oder des Verteidigungsministeriums dar. Wir möchten auch dem McNair Medical Institute und Charif Souki für ihre fortlaufende und großzügige Unterstützung der damit verbundenen Forschung danken.

Abteilung für Molekular- und Humangenetik, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA

Jessica L. Swanson, Joshua Ortiz-Guzman, Snigdha Srivastava, Sean W. Dooling, Elizabeth Hanson Moss, Mikhail Y. Kochukov, Patrick J. Hunt, Brandon T. Pekarek und Benjamin R. Arenkiel

Jan und Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, Houston, TX, USA

Jessica L. Swanson, Joshua Ortiz-Guzman, Snigdha Srivastava, Elizabeth Hanson Moss, Mikhail Y. Kochukov, Patrick J. Hunt, Jay M. Patel, Brandon T. Pekarek und Benjamin R. Arenkiel

Ausbildungsprogramm für medizinische Wissenschaftler, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA

Snigdha Srivastava, Patrick J. Hunt und Jay M. Patel

Abteilung für Neurowissenschaften, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA

Pey-Shyuan Chin, Jay M. Patel und Benjamin R. Arenkiel

Zentrum für metabolische und degenerative Erkrankungen, Health Science Center der University of Texas in Houston, Houston, TX, USA

Qingchun Tong

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JLS: Konzeptualisierung, experimentelles Design, Durchführung von Experimenten, Datenerfassung, Datenanalyse, Verfassen und Bearbeiten von Manuskripten, Erstellung von Figuren. JOG: Mentoring und praktische Schulung, Konzeptualisierung, experimentelles Design, Durchführung von Experimenten. SS: Datenerfassung, Datenanalyse, Figurenerstellung. PC: Datenerfassung, Datenanalyse, Abbildungserstellung, Manuskriptbearbeitung. SWD: Experimente durchführen, Daten sammeln, Datenanalyse. EHM: Experimente durchführen, Daten sammeln, Datenanalyse, Manuskriptbearbeitung. MYK: Experimente durchführen, Daten sammeln, Datenanalyse. PJH: Durchführung von Experimenten, Datenerfassung, Datenanalyse, Bearbeitung von Manuskripten, Erstellung von Figuren. JMP: Konzeptualisierung, Mentoring, experimentelles Design, Manuskriptbearbeitung. BTP: Mentoring, Datenanalyse, Manuskriptbearbeitung. QT: Konzeptualisierung, Mentoring, Manuskriptbearbeitung. BRA: Mentoring, Konzeptualisierung, experimentelles Design, Manuskriptbearbeitung.

Korrespondenz mit Benjamin R. Arenkiel.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Swanson, JL, Ortiz-Guzman, J., Srivastava, S. et al. Die Aktivierung der Schaltkreise vom basalen Vorderhirn zur seitlichen Habenula führt zu einer reflexiven Abneigung und unterdrückt das Fressverhalten. Sci Rep 12, 22044 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26306-8

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Eingegangen: 24. August 2022

Angenommen: 13. Dezember 2022

Veröffentlicht: 21. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26306-8

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