Einzelzell-Transkriptomsequenzierung inspiratorischer Neuronen des Prä-Bötzinger-Komplexes bei neugeborenen Mäusen

Scientific Data Band 9, Artikelnummer: 457 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Neuronen im Hirnstamm-Prä-Bötzinger-Komplex (preBötC) erzeugen den Rhythmus und rudimentäre motorische Muster für inspiratorische Atembewegungen. Wir führten Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von inspiratorischen Neuronen im präBötC neonataler Mausschnitte durch, die in vitro die atembezogene Rhythmik beibehalten. Wir klassifizierten Neuronen anhand ihrer elektrophysiologischen Eigenschaften und ihres genetischen Hintergrunds und aspirierten dann ihren Zellinhalt für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq). Dieser Datensatz stellt die rohen Nukleotidsequenzen (FASTQ-Dateien) und annotierte Dateien von Nukleotidsequenzen bereit, die dem Mausgenom zugeordnet sind (mm10 von Ensembl), einschließlich der Fragmentzahlen, Genlängen und Fragmente pro Kilobase Transkript pro Million kartierter Lesevorgänge (FPKM). ). Diese Daten spiegeln die Transkriptome der Neuronen wider, die den Rhythmus und das Muster für inspiratorische Atembewegungen erzeugen.

Messungen)

Nukleotidsequenzen

Technologietyp(en)

Illumina-Sequenzierung

Faktortyp(en)

Genotyp: Dbx1-abgeleitete vs. nicht-Dbx1-abgeleitete Neuronen im Prä-Bötzinger-Komplex der Maus. • Elektrophysiologische Eigenschaften: Typ-1- vs. Typ-2-inspiratorische Prä-Bötzinger-Komplex-Neuronen

Probenmerkmal – Organismus

Mausmuskel

Probeneigenschaft – Umgebung

Laborumgebung

Probenmerkmal – Standort

angrenzende Vereinigte Staaten von Amerika

Die unerbittliche aktive Phase der Atmung ist die Inspiration, in der sich die Lunge durch das Absenken des Zwerchfells und das Anheben der Rippen ausdehnt, um Luft anzusaugen1. Der Inspirationsrhythmus geht von der unteren Hirnstammstelle aus, die als Prä-Bötzinger-Komplex (preBötC)2,3,4 bezeichnet wird. Die wichtigsten rhythmogenen Elemente des preBötC sind Interneurone, die aus Vorläuferzellen stammen, die das Homöobox-Gen exprimieren. Sich entwickelndes Gehirn-Homöobox-1 (Dbx1), im Folgenden als Dbx1-Neuronen bezeichnet5,6,7,8,9,10. Dbx1-Neuronen übertragen den Inspirationsrhythmus auch als Ausgabemuster an Prämotoneuronen und Motoneuronen für Pump- und Atemwegsmuskeln11,12. Die Inspiration beginnt mit einer präinspiratorischen Phase, die ausschließlich rhythmogenen Neuronen zugeschrieben wird11,13,14. Wenn ihre Aktivität einen Schwellenwert erreicht, kommt es zu einem Inspirationsstoß, der Neuronen rekrutiert, die das Muster für die motorische Leistung beeinflussen und übertragen13,14,15. Rhythmus- und mustererzeugende Neuronen sind die beiden Untergruppen der Dbx1-Neuronenpopulation im preBötC.

Die Rhythmus- und Mustergeneratoren können elektrophysiologisch unterschieden werden. Typ-1-Neuronen sind vermutlich rhythmogen. Sie werden mit einer rampenartigen Summierung synaptischer Potenziale 300–500 ms vor dem Einsetzen eines großen Inspirationsstoßes aktiviert16,17. Typ-1-Neuronen exprimieren einen transienten K+-Strom (IA) vom A-Typ. Die Blockade der IA destabilisiert den Inspirationsrhythmus und die gesamte präinspiratorische Aktivität in vitro18. Typ-2-Neuronen sind vermutlich auf die Erzeugung des Ausgabemusters spezialisiert. Sie werden ca. 300 ms später aktiviert als Typ 116,17 und exprimieren einen durch Hyperpolarisation aktivierten gemischten kationischen Strom (Ih), dessen Manipulation die Motorleistung beeinflusst19.

Wir haben Typ-1- und Typ-2-Neuronen elektrophysiologisch während Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen unterschieden. Trotz der gut charakterisierten Unterschiede zwischen den Typen weisen einige Neuronen eine unklare Physiologie auf und können nicht zuverlässig klassifiziert werden; Wir nennen diese unbekannt, halten sie aber dennoch für wichtig für die Atmung, da sie sich im präBötC befinden und in vitro in Phase mit der Inspiration rhythmisch aktiv sind. Wir haben zytoplasmatische Inhalte abgerufen und eine Next-Generation-RNA-Sequenzierung an 10 Proben durchgeführt: vier Typ-1-Neuronen (drei von Dbx1-exprimierenden Vorläufern und eines von einer CD-1-Wildtyp-Maus ohne Dbx1-Reporter), ein Typ-2-Neuron aus einem Dbx1-exprimierenden Vorläufer sowie 5 unbekannten Neuronen aus CD-1-Wildtyp-Mäusen. Alle Neuronen wurden erfasst und innerhalb von zwei Monaten RNA extrahiert und gemeinsam zur Sequenzierung der nächsten Generation geschickt.

Das Institutional Animal Care and Use Committee bei William & Mary genehmigte diese Protokolle, die den Richtlinien des Office of Laboratory Animal Welfare (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) und den Richtlinien des National Research Council20 entsprechen. CD-1-Mäuse (Charles River, Wilmington, MA) und genetisch veränderte Mäuse (unten beschrieben) wurden in einem 14-Stunden-Licht/10-Stunden-Dunkel-Zyklus bei 23 °C gehalten und nach Belieben mit freiem Zugang zu Wasser gefüttert.

Für die Experimente wurden CD-1-Mäuse oder ein intersektionales Mausmodell namens Dbx1;Ai148 verwendet. Bezüglich der Nomenklatur für das intersektionale Modell bezieht sich der erste Teil auf Dbx1Cre-Mäuse (IMSR Cat# EM:01924, RRID:IMSR_EM:01924), die Cre-Rekombinase exprimieren, die durch den Dbx1-Promotor gesteuert wird21. Der zweite Teil, Ai148 (IMSR Cat# JAX:030328, RRID:IMSR_JAX:030328), bezieht sich auf Cre-Responder-Mäuse, die vom Allen Brain Institute geschaffen wurden und den fluoreszierenden Ca2+-Indikator GCaMP6f nach Cre-vermittelter Rekombination von Flox-Allelen exprimieren22. Wir kreuzten weibliche Dbx1Cre-Mäuse mit männlichen Ai148-Mäusen, um Nachkommen mit GCaMP6f-Expression in von Dbx1 abgeleiteten Neuronen zu erzeugen.

Wir haben vor jedem Experiment alle Arbeitsbereiche mit RNase ZAP (Thermo Fisher, Waltham, MA) gereinigt. Werkzeuge und Glaswaren wurden autoklaviert oder mit RNase ZAP gereinigt und anschließend mit nukleasefreiem Wasser (NFW) gespült.

Wir betäubten CD-1- oder Dbx1;Ai148-Welpen (Alter 0–3 Tage nach der Geburt, d. h. P0–3) durch Hypothermie gemäß den Richtlinien der American Veterinary Medical Association (AVMA, Schaumburg, IL), Version 2020.0.1, die lizenziert ist unter der Creative Commons Attribution-Non-Commercial-NoDerivs 3.0. Wir entfernten die Neuraxis innerhalb von 2 Minuten von der Brücke zum Halswirbelsäulenmark und platzierten sie in eiskalter künstlicher Liquor cerebrospinalis (aCSF), die (in mM) enthielt: 124 NaCl, 3 KCl, 1,5 CaCl2, 1 MgSO4, 25 NaHCO3, 0,5 NaH2PO4 und 30 Dextrose. aCSF wurde vorab in einer RNase-freien Umgebung hergestellt und dann während der Experimente mit 95 % O2 und 5 % CO2 durchströmt. Die Neuraxis wurde zugeschnitten, um den Hirnstamm zu isolieren, und dann auf die dorsale Oberfläche eines Agarblocks geklebt und dann in einem Schraubstock in einem Vibratom (Campden Instruments 7000 smz-2, Leicester, UK) positioniert, das mit eiskaltem, mit 95 % belüftetem aCSF gefüllt war % O2 und 5 % CO2. Wir haben eine 450–500 µm dicke Querscheibe mit preBötC auf der rostralen Oberfläche geschnitten23. Der Schnitt wurde nicht länger als 3 Stunden verwendet, um einen Abbau und eine Kontamination des zytoplasmatischen genetischen Inhalts zu vermeiden.

Abbildung 1a (oben) zeigt unseren Elektrophysiologie-Workflow. Wir perfundierten Schnitte mit aCSF (28 °C) bei 2–4 ml/min in einer Aufnahmekammer auf einem Physiologiemikroskop (Zeiss Axio Examiner, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Deutschland). Die externe K+-Konzentration des aCSF wurde von 3 auf 9 mM erhöht, um einen robusten Atemrhythmus und eine hypoglossale (XII) motorische Leistung zu ermöglichen4,24. Wir haben die XII-Motorleistung mithilfe von Saugelektroden aufgezeichnet, die aus autoklavierten Borosilikatglaspipetten (Außendurchmesser: 1,2 mm, Innendurchmesser: 0,68 mm) hergestellt und zunächst auf einem Flaming-Brown P-97-Mikropipettenzieher (Sutter Instruments, Novato, CA) gezogen und dann feuerpoliert wurden bis zu einem Durchmesser von ~100 µm. Die XII-Motorleistung wurde mit einem Differenzverstärker (EX1, Dagan Instruments, Minneapolis, MN) um das 2.000-fache verstärkt, bei 0,3–1 kHz bandpassgefiltert und für die Anzeige mit einem analogen Effektivwertfilter (Analog Devices, Norwood) geglättet , MA), um eine vollweggleichgerichtete und geglättete XII-Wellenform bereitzustellen. In Dbx1;Ai148-Mausschnitten identifizierten wir inspiratorische Dbx1-preBötC-Neuronen basierend auf rhythmischen Fluoreszenzänderungen synchron mit der XII-Ausgabe, bevor wir eine Patch-Clamp-Aufzeichnung für die gesamte Zelle erhielten. In CD-1-Mäusen identifizierten wir inspiratorische präBötC-Neuronen, die synchron mit der XII-Motorleistung aktiviert wurden, nachdem die Ganzzellaufzeichnung etabliert war. Wir haben Patchpipetten aus autoklaviertem Borosilikatglas (Außendurchmesser: 1,5 mm, Innendurchmesser: 0,86 mm) mithilfe eines 4-Stufen-Programms auf dem Mikropipettenzieher Flaming-Brown P-97 hergestellt. Spitzenwiderstand gemessen 3–5 MΩ. Wir füllten Patchpipetten mit interner Lösung, gemischt in einer RNase-freien Umgebung, enthaltend (in mM): 123 K-Gluconat, 12 KCl, 10 HEPES, 0,2 EGTA, 4 Mg-ATP, 0,3 Na-GTP, 10 Na2-Phosphokreatin und 13 Glykogen. Wir stellten die Osmolarität der internen (Patch-)Lösung auf 260–270 mOsm ein und hielten den pH-Wert bei 7,25. Wir haben unmittelbar vor jedem Experiment 1–2,5 % rekombinanten Ribonuklease-Inhibitor (RRI) (Takara Bio USA, Mountain View, CA) zur internen Lösung hinzugefügt, um die RNA zu konservieren. Roboter-Mikromanipulatoren (Sensapex, Helsinki, Finnland) wurden eingesetzt, um die Patchpipetten unter visueller Kontrolle neben inspiratorischen Neuronen zu positionieren. Wir haben Ganzzellen-Patch-Clamp-Aufzeichnungen mit einem EPC-10-Patch-Clamp-Verstärker (HEKA Instruments, Holliston, MA) und der PATCHMASTER-Software (RRID:SCR_000034) durchgeführt.

Schematischer Überblick über das experimentelle Design. (a) Der Patch-Seq-Workflow. Rhythmisch aktive Dbx1-abgeleitete preBötC-Neuronen werden in der Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration (VM, obere Spur) aufgezeichnet. Der hypoglossale Hirnnerv (XII) repräsentiert die inspiratorische motorische Leistung (untere Kurve). a_i – a_iv stellen Schritte im Patch-Seq-Workflow grafisch dar, wie unter Methoden beschrieben. (b) Flussdiagramm b_i–b_v, das den Bioinformatik-Workflow zeigt, wie unter „Methoden“ beschrieben.

Wir definierten die Latenz des Inspirationsantriebs als die verstrichene Zeit zwischen dem Beginn der Summierung erregender synaptischer Potenziale (EPSPs), die das Neuron zwischen den Inspirationsstößen aus seinem Ruhemembranpotenzial depolarisieren, bis zum Einsetzen des Inspirationsstoßes. Die Latenz des Inspirationsantriebs wurde teilweise verwendet, um zu bestimmen, ob ein Neuron vom Typ 1 oder vom Typ 2 war (Abb. 1ai). PreBötC-Neuronen vom Typ 1 zeigen eine inspiratorische Antriebslatenz von mehr als 300 ms, während preBötC-Neuronen vom Typ 2 eine inspiratorische Antriebslatenz in der Größenordnung von 100 ms aufweisen (vergleiche Abb. 2a, links und b, links).

Elektrophysiologische Profile von präBötC-Neuronen. (a) ein Typ-1-Neuron, das durch eine lange inspiratorische Antriebslatenz (links), eine verzögerte Erregung (Mitte) und das Fehlen eines „Durchhang“-Potentials (rechts) gekennzeichnet ist. (b) ein Typ-2-Neuron, das durch eine kurze inspiratorische Antriebslatenz (links), keine verzögerte Erregung (Mitte) und das Vorhandensein eines Durchhangpotentials (rechts) gekennzeichnet ist.

Wir haben den A-Typ-K+-Strom (IA) getestet, der für Typ-1-preBötC-Neuronen charakteristisch ist, indem wir depolarisierende Stromschrittbefehle über der Schwelle mit einer Dauer von 500 ms aus einem Haltepotential von –70 mV anwendeten. PräBötC-Neuronen vom Typ 1, die IA exprimieren, zeigten eine verzögerte Erregung von 120–220 ms, während präBötC-Neuronen vom Typ 2 ohne IA-Expression keine verzögerte Erregung als Reaktion auf ähnliche depolarisierende Stromschrittbefehle zeigten16, 17, 25 (vergleiche Abb. 2a, Mitte vs. b, Mitte).

Wir haben den hyperpolarisationsaktivierten kationischen Strom (Ih) getestet, indem wir hyperpolarisierende Stromschrittbefehle mit einer Dauer von 400–500 ms angewendet haben, die bei einem Haltepotential von –50 mV anfängliche Spannungsausschläge von mehr als –20 mV verursachten. PräBötC-Neuronen vom Typ 2, die Ih exprimieren, zeigten einen zeit- und spannungsabhängigen depolarisierenden „Durchhang“, wohingegen PräBötC-Neuronen vom Typ 1 ohne Ih-Expression keine Durchhangpotentiale als Reaktion auf ähnliche hyperpolarisierende Stromschrittbefehle zeigen16, 17, 25 (vergleiche Abb. 2a). , rechts vs. b, rechts).

Abbildung 1a (unten) zeigt ein Schema unseres Arbeitsablaufs, um zytoplasmatische Inhalte zu erhalten und eine komplementäre DNA-Bibliothek (cDNA) zu erstellen, die für die Sequenzierung der nächsten Generation geeignet ist. Nach der Kategorisierung der Neuronen entweder als Typ-1 oder Typ-2 auf der Grundlage der inspiratorischen Antriebslatenz und der Expression bzw. dem Fehlen derselben von IA und Ih; oder sie als unbekannt zu klassifizieren, extrahierten wir den Zellinhalt mit einem Unterdruck von 0,7–1,5 psi (Abb. 1aii). Die Patch-Pipette wurde schnell zurückgezogen und der Inhalt der Pipette durch Abbrechen der Spitze am Boden eines RNase-freien PCR-Röhrchens mit 4 µL nukleasefreiem Wasser mit 2 % RRI ausgeworfen. Die Probe wurde kurz geschleudert, sofort durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff eingefroren und dann bei –80 °C gelagert. Wir haben die extrahierte RNA gemäß dem Ultra-Low-Input-RNA-Kit für das Sequenzierungsprotokoll SMART-Seq v4 (Takara Bio USA) in cDNA umgewandelt (Abb. 1aiii). Die Erststrang-cDNA wurde durch Reverse Transkription in einem Thermocycler (42 °C für 90 Minuten, 70 °C für 10 Minuten) synthetisiert. Die cDNA wurde dann 1 Minute lang bei 95 °C, 17 Zyklen von 10 Sekunden lang bei 98 °C, 30 Sekunden lang bei 65 °C und 3 Minuten lang bei 68 °C amplifiziert; 72 °C für 10 Min. PCR-amplifizierte cDNA wurde durch Immobilisierung auf AMPure-Kügelchen (Beckman Coulter, Brea, CA) gereinigt, die wir mit 80 % Ethanol wuschen, bevor wir die cDNA von den Kügelchen eluierten. Die amplifizierte cDNA wurde mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer und dem High Sensitivity Kit von Agilent (5067-4626, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) validiert. Proben, die einen Schwellenwert von 20 Fluoreszenzeinheiten im Bereich von 1500–2000 Basenpaaren überschritten und nur einen geringen oder keinen Peak im Bereich von 100–500 Basenpaaren aufwiesen (z. B. Abb. 1aiii), wurden dann mit dem Qubit dsDNA High-sensitivity Assay Kit quantifiziert (Molecular Probes, Eugene, OR). Proben mit einer cDNA-Konzentration von mehr als 150 pg/µL wurden für die Sequenzierung der nächsten Generation aufbewahrt26. Wir haben cDNA voller Länge mit Nextera-Bibliotheksvorbereitungskits (FC-131-1024, Illumina, San Diego, CA) verarbeitet, um cDNA-Bibliotheken für die Sequenzierung der nächsten Generation mit einem Illumina HiSeq zu erhalten. 4000-Sequenzierungssystem mit Paired-End-Reads (150 bp) (Abb. 1aiv). Beim Aufbau und der Sequenzierung der Bibliothek waren die Forscher hinsichtlich des Zelltyps blind.

Abbildung 1b zeigt das Schema für unseren Bioinformatik-Workflow. Zunächst wurde die Qualität der Lesevorgänge mit FastQC v0.11.8 überprüft (Abb. 1bi). Adapter-Lesevorgänge (Read 1: TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG, Read 2: GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG) wurden mit bbduk v38.00 mit dem folgenden Befehl gekürzt (Abb. 1bii):

sh bbduk.sh in1 = inputFASTQFile1.fastq. in2 = inputFASTQFile2.fastq out1 = OutputFASTQFile1.fastq out2 = OutputFASTQFile2.fastq ktrim = r -Xmx27g mm = fk = 33 hdist = 1 literal = TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG,GTCTCGTGGGCTCGGAG ATGTGTATAAGAGACAG tbo tpe

Wir haben das mm10-Maus-Referenzgenom von Ensembl (vom European Bioinformatics Institute der European Molecular Biology Laboratory-Familie) verwendet, um ein Genomverzeichnis zum Ausrichten der Lesevorgänge in STAR27 v2.7.7a mit den folgenden Befehlen zu erstellen:

STAR --runMode genomeGenerate --genomeDir mm10ReferenceGenome --genomeFastaFiles Mus_musculus.GRCm38.dna.primary_assembly.fa --sjdbGTFfile Mus_musculus.GRCm38.102.gtf --sjdbOverhang 149 --genomeSAsparseD 2

Die Sequenzen wurden dann von STAR v2.7.7a27 mit dem folgenden Befehl mit dem mm10-Referenzgenom abgeglichen (Abb. 1biii):

STAR --genomeDir mm10ReferenceGenome --readFilesIn inputFASTQFile1.fastq inputFASTQFile2.fastq --outFileNamePrefix outputBAMFile --outSAMtype BAM SortedByCoordinate --outReadsUnmapped Fastx

Wir haben featureCounts v2.4.2 verwendet, um die Fragmentanzahl der erkannten Gene zu quantifizieren (Abb. 1biv). Darüber hinaus haben wir benutzerdefinierte Skripte (siehe Codeverfügbarkeit unten) in der statistischen Rechenumgebung „R“ entwickelt, um Textdateien mit Genlängen, Fragmentzahlen und FPKMs zu generieren, die auf NCBI GEO verfügbar sind (Abb. 1bv).

Die Rohdaten bestehend aus Nukleotidsequenzen (FASTQ-Dateien) zusammen mit den Rohfragmentzahlen der verarbeiteten Daten nach Ausrichtung auf mm10 (GSE175643_fragmentCounts.txt.gz), den FPKM-Werten der in den Fragmenten dargestellten Gene (GSE175643_fpkm.txt.gz) und die Längen der Gene von mm10 (GSE175643_geneLength.txt.gz) sind in der NCBI GEO-Datenbank (GEO:GSE175643)28 öffentlich verfügbar.

Die bei Figshare hinterlegte Datei mit dem Titel „Electrophysiologische Eigenschaften von inspiratorischen präBötzinger-Komplexneuronen bei neonatalen Mäusen (GEO:GSE175643)“ zeigt das elektrophysiologische Profil für jedes Proben-präBötC-Neuron im Datensatz29. Die bei Figshare hinterlegte Datei mit dem Titel „Mapping Statistics for Nucleotide Sequences for Inspiratory PreBötzinger Complex Neurons in Neonatal Mices (GEO:GSE175643)“ enthält eine Reihe von Statistiken von STAR bezüglich der Anzahl der Lesevorgänge und ihrer Längen, die auf das mm10-Referenzgenom abgebildet werden29.

Wir haben die durchschnittliche cDNA-Größe und -Häufigkeit mithilfe eines Bioanalyzer High Sensitivity Kit (Agilent, Santa Clara, CA) und eines Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit (Molecular Probes) überprüft. Die Rohdaten der Nukleotidsequenzen sind zusammen mit den entsprechenden Qualitätsbewertungen (FASTQ-Format) in der NCBI GEO-Datenbank (GEO:GSE175643) öffentlich verfügbar.

In Bezug auf die Qualitätswerte zeigten alle 20 FastQC-Berichte (zwei Paired-End-Reads von 10 Beispiel-PreBötC-Neuronen) Qualitätswerte pro Sequenz von durchschnittlich 38–40. Keine der Sequenzen wurde als minderwertig gekennzeichnet.

Die hier beschriebenen Transkriptomdaten wurden mit Techniken gesammelt, die mit den in Kallurkar et al. analysierten Daten identisch sind. Sci Rep, 12:2923, 2022, das aus 17 Dbx1-preBötC-Neuronen bestand (sieben Typ-1-, neun Typ-2- und ein unbekanntes)25. Im Folgenden bezeichnen wir diese Daten als „Kallurkar 2022“. Die vorliegenden Daten wurden jedoch etwa 1,5 Jahre zuvor gesammelt und zur Sequenzierung gesendet, sodass wir einen Batch-Effekt testen wollten, der zu Abweichungen zwischen diesen beiden Datensätzen führen könnte. Um auf Batch-Effekt-Disparitäten zu prüfen, haben wir Boxplots30 für jede Probe erstellt, die die logarithmische Expression von 8.916 Genen mit einer Expression ungleich Null in mehr als zwei Dritteln der Proben aus Kallurkar 2022 und dem vorliegenden Datensatz (d. h. 19 von insgesamt 27) zusammenfassen Proben). Diese 8.916 Gene stellen 16 % der 55.367 Gene im mm10-Referenzgenom dar. Abbildung 3 zeigt, dass der mittlere log10(FPKM) für Kallurkar 2022 (graue Boxplots, Stichproben 1–9 und 11–18) und die aktuellen Daten (schwarze Boxplots, Stichproben 1–10) bei etwa 1,0 liegt. Die Länge der Boxplots, die sich über das untere und obere Quartil erstrecken, beträgt typischerweise eine Dekade (d. h. ein Faktor von 10 in FPKM), einige sind jedoch auch bis zu drei Dekaden (ein Faktor von 1000 in FPKM). Die Proben 1–4 im vorliegenden Datensatz zeigen jedoch einen mittleren log10(FPKM) <0,5 und eine Boxlänge von drei Jahrzehnten. Diese Statistiken zeigen, dass die Proben 1–4 für einen Teil der erkannten Gene niedrigere Expressionsniveaus und eine höhere Variabilität im Vergleich zu Kallurkar 2022 und den Proben 5–10 aufweisen. Um das Expressionsniveau und die Variabilität weiter zu untersuchen, haben wir den Median von log10 (FPKM) gegen die mittlere absolute Abweichung (MAD) von log10 (FPKM) aufgetragen (Abb. 4). Die Proben 1–4 (gefüllte Kreise mit Ziffern) sind im Vergleich zu den Proben 5–10 (gefüllte Kreise) und Kallurkar 2022 (offene Kreise) oben links positioniert, was wiederum mit einer geringeren Genexpression und einer höheren Variabilität vereinbar ist. Abschließend untersuchten wir ein Histogramm von log10(FPKM) für Kallurkar 2022 und die vorliegenden Daten (Abb. 5). Kallurkar 2022 (graue Linie) überlagert sich gut mit den Proben 5–10 (durchgezogene schwarze Linie) und dem höchsten Peak der Proben 1–4 im aktuellen Datensatz (gestrichelte schwarze Linie). Die Proben 1–4 weisen jedoch einen weiteren Peak in der Verteilung bei log10(FPKM) nahe –2 auf, was auf eine Reihe niedrig exprimierter Gene hinweist, die für die höhere Variabilität der Proben 1–4 verantwortlich sind. Bemerkenswert ist, dass die Proben 1–4 laut Qubit-Quantifizierung die niedrigste cDNA-Konzentration aufwiesen, obwohl alle vier das 150 pg/µL-Kriterium erfüllten26. Die Proben 1–4 haben einen mittleren log10(FPKM), der um den Faktor 10 niedriger ist als die Proben 5–10 und Kallurkar 2022 (Abb. 5, vertikale Linien).

Boxplots, die die Expressionsniveaus der 8.916 Gene zeigen, die in 19 Transkriptomen von präBötC-Neuronen entweder von Kallurkar et al., 2022 (Lit. 25) oder den 10 Proben im vorliegenden Bericht exprimiert werden. Bei den Kallurkar 2022-Datensätzen handelt es sich um die Stichproben 1–9 und 11–18 (Gray-Box-Plots). Bei den vorliegenden Datensätzen handelt es sich um die Stichproben 1–10 (Black-Box-Plots). Der mittlere log10(FPKM) wird durch einen Bullseye-Punkt in der Mitte des Boxplots angezeigt, der das obere und untere Quartil zeigt. Punkte zeigen Genexpressionsniveaus außerhalb des Interquartilbereichs an.

Ein Diagramm der mittleren absoluten Abweichung (MAD) von log10(FPKM) vs. mittleren log10(FPKM) der 8.916 Gene, die in mindestens 19 Transkriptomen von präBötC-Neuronen exprimiert wurden, von Kallurkar et al., 2022 (Lit. 25) ( offene Kreise) oder die 10 Proben im vorliegenden Bericht (geschlossene Kreise). Die Proben 1–4 mit hohem MAD und niedrigem Medianwert werden außerdem mit Ziffern angegeben, die dem Probennamen entsprechen.

Histogramm, das die Wahrscheinlichkeit des Genexpressionsniveaus für die 8.916 Gene zeigt, die in mindestens 19 Transkriptomen von präBötC-Neuronen exprimiert werden, entweder von Kallurkar et al., 2022 (Lit. 25) (graue durchgezogene Linie) oder den 10 Proben im vorliegenden Bericht (gestrichelte schwarze Linie). für die Proben 1–4 und durchgezogene schwarze Linie für die Proben 5–10). Die Höhen des ersten Bins (0,13, 0,05 und 0,09) entsprechen dem Anteil der mm10-Gene, die im Kallurkar 2022 und in den vorliegenden Datensätzen nicht exprimiert werden.

Wir haben die vorliegenden Daten außerdem mithilfe von Kartierungsstatistiken mit Kallurkar 2022 verglichen. Der Anteil der Nullen (d. h. der Anteil der Gene in mm10, die unentdeckt blieben) betrug in den vorliegenden Daten 0,775 und in Kallurkar 2022 0,762. Die bei Figshare hinterlegte Datei mit dem Titel „Mapping Statistics for Nucleotide Sequences for Inspiratory PreBötzinger Complex Neurons in Neonatal Mouses“ GEO:GSE175643)“ listet die Kartierungsstatistiken im Detail für Nukleotidsequenzen auf, die dem mm10-Maus-Referenzgenom eindeutig, mehrfach kartiert oder nicht zugeordnet sind30. Kartierungsstatistiken für Kallurkar 2022 sind mit Ref. verknüpft. 25. Kurz gesagt stellt 0,85 ± 0,04 den Bruchteil der Sequenzen aus dem vorliegenden Datensatz dar, die eindeutig auf mm10 abgebildet sind, 0,05 ± 0,02 stellt den mehrfach abgebildeten Bruchteil dar und 0,10 ± 0,03 stellt den nicht kartierten Bruchteil dar. In Kallurkar 2022 stellt 0,56 ± 0,14 den Anteil der Sequenzen dar, die eindeutig auf mm10 abgebildet sind, 0,04 ± 0,01 stellt den mehrfach zugeordneten Anteil dar und 0,16 ± 0,07 stellt den nicht zugeordneten Anteil dar.

Wir stellen außerdem fest, dass die Qualitätsberichte für Kallurkar 2022 und die vorliegenden Daten ähnliche Werte für die „Pro-Base-Sequenzierungsqualität“ liefern, die 35 oder höher betrug und keine Sequenzen als schlechte Qualität gekennzeichnet waren.

Insgesamt schließen die Log-Expression-Boxplots und Folgeanalysen größere technische Unterschiede zwischen dem Kallurkar 2022 und den vorliegenden Datensätzen aus, mit dem Vorbehalt, dass ein Teil der erkannten Gene in den Proben 1–4 im Vergleich dazu eine geringere Gesamtexpression und eine höhere Variabilität aufwies Proben 5–10 und alle Proben in Kallurkar 2022. Dennoch unterstreicht der relativ hohe Anteil eindeutig kartierter Sequenzen und der niedrige Anteil nicht kartierter Sequenzen die Qualität des vorliegenden Datensatzes.

Zurück zu unserer Betrachtung des vorliegenden Datensatzes: Sechs inspiratorische präBötC-Neuronen wurden in CD-1-Mäusen aufgezeichnet. Wir konnten nur ein Typ-1-Neuron in CD-1-Mausschnitten unterscheiden; Die anderen fünf waren vom unbekannten Typ. Wir sind relativ sicher, dass das Typ-1-Neuron aufgrund seiner Membraneigenschaften erregend und rhythmogen war. Wir können jedoch nicht sicher sein, welchen Sendertyp oder welche atembezogene Funktion die fünf unbekannten Neuronen von CD-1-Wildtyp-Mäusen haben.

Von den vier Dbx1-preBötC-Neuronen haben wir drei Typ-1-Neuronen, aber nur ein Typ-2-Neuronen entdeckt. Es wäre schwierig, auf der Grundlage eines einzelnen Typ-2-Transkriptoms Rückschlüsse auf die unterschiedliche Expression zwischen Dbx1-preBötC-Neuronen vom Typ 1 und Typ 2 zu ziehen. Angesichts der minimalen Batch-Effekte (siehe oben) könnte man das Typ-2-Transkriptom hier mit den Transkriptomen analysieren, die zuvor im Bericht von Kallurkar et al. verbreitet wurden25.

In Abb. In den Abbildungen 6 und 7 heben wir die Expressionsniveaus von Genen hervor, die für Atemphysiologen von allgemeinem Interesse sind. Die Balken sind farblich gekennzeichnet und zeigen Typ 1 (Magenta), Typ 2 (Orange) und Unbekannt (Grün) an. Die Höhe der Balken entspricht dem log2(FPKM)-Expressionsniveau für jedes Gen. Lila Balken zeigen den Mittelwert und die Standardabweichung über die gesamte Stichprobe. Abbildung 6 umfasst ionotrope und metabotrope synaptische Rezeptoren, Neuropeptide, Neuropeptidrezeptoren, transiente Rezeptorpotentialkanäle (dh Trp) und Reelin (RLN). Abbildung 7 zeigt spannungsabhängige Ionenkanäle, regulatorische Untereinheiten und intrazelluläre Rezeptoren.

Genexpressionsniveaus für ionotrope und metabotrope synaptische Rezeptoren, Neuropeptide, Neuropeptidrezeptoren, transiente Rezeptorpotentialkanäle (z. B. Trp) und Reelin (RLN). Der erste Balken (lila) stellt das allgemeine Genexpressionsniveau für alle Proben dar (N = 10). Die Balken rechts sind nach Neuronentyp gruppiert, in der Reihenfolge ihrer Auflistung in der NCBI GEO-Datenbank (#GSE175643): Die Proben 1–6 stammen von CD-1-Mäusen; Die Proben 7–10 stammen von Dbx1;Ai148-Mäusen. Typ-1-Neuronen (rosa) entsprechen den Proben 4–7; das Typ-2-Neuron (orange) entspricht Probe 1; und Unbekannte Neuronen (grün) entsprechen den Proben 2, 3, 8–10. Die Höhe des Balkens stellt den log2-Wert (mittlerer FPKM) dar; Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung über alle Proben hinweg (nur violette Balken).

Genexpression für spannungsabhängige Ionenkanäle, regulatorische Untereinheiten und intrazelluläre Rezeptoren. Der erste Balken (lila) stellt das allgemeine Genexpressionsniveau für alle Proben dar (N = 10). Die Balken auf der rechten Seite sind nach Neuronentyp gruppiert, in der Reihenfolge ihrer Auflistung in der NCBI-GEO-Datenbank (#GSE175643): Die Proben 1–6 stammen von CD-1-Mäusen; Die Proben 7–10 stammen von Dbx1;Ai148-Mäusen. Typ-1-Neuronen (rosa) entsprechen den Proben 4–7; das Typ-2-Neuron (orange) entspricht Probe 1; und Unbekannte Neuronen (grün) entsprechen den Proben 2, 3, 8–10. Die Höhe des Balkens stellt den log2-Wert (mittlerer FPKM) dar; Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung über alle Proben hinweg (nur violette Balken).

Die Neuronen, deren Transkriptome wir hier präsentieren, sind die gleiche Population von Dbx1-abgeleiteten und nicht-Dbx1-abgeleiteten Neuronen, die von Hayes und Kollegen beschrieben wurden31. Allerdings wurden in dieser Studie die präBötC-Neuronen nicht intrazellulär erfasst. Man könnte die vorliegenden präBötC-Neuronentranskriptome mit denen von Hayes et al. vergleichen. Dabei ist zu berücksichtigen, dass die physiologischen Phänotypen der letztgenannten Neuronen nicht identifiziert wurden31.

Die benutzerdefinierten R-Skripte, die zur Verarbeitung der Rohfragmentzahlen geschrieben wurden, sind frei verfügbar (https://github.com/prajkta9/bioinformatics-scRNA-seq).

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Gefördert durch NIH R01 HL104127 (PI: Del Negro), NIH R01 NS107296 (PI: Del Negro), NIH R01 AT01816 (PI: Conradi Smith und Del Negro), NSF DMS 1951646 (PI: Conradi Smith), NSF DEB 2031275 (PI). : Conradi Smith), NIH R15 HD096415 (PI: Saha). Die Autoren danken Kyle T. David (ORCID ID: 0000-0001-9907-789X), der mit dem benutzerdefinierten R-Skript bei der Erstellung von Abb. 2 geholfen hat.

Department of Applied Science, William & Mary, 540 Landrum Drive, Williamsburg, Virginia, 23185, USA

Caroline K. David, Prajkta S. Kallurkar, Maria Cristina D. Picardo, Gregory D. Conradi Smith und Christopher A. Del Negro

Abteilung für Neurowissenschaften, Jikei University School of Medicine, 3-25-8 Nishi-shimbashi, Minato, Tokio, 105-8461, Japan

Yae K. Sugimura

Department of Biology, William & Mary, 540 Landrum Drive, Williamsburg, Virginia, 23185, USA

Margaret S. Saha

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Caroline K. David kuratierte die Daten, entwarf und erstellte einige der Abbildungen und schrieb Teile des Manuskripts mit CADN. Yae K. Sugimura half bei der Konzeption der Studie, zeichnete die präBötC-Neuronen im Ganzzell-Patch-Clamp-Modus auf, charakterisierte die Neuronen, sammelte dann ihren zytoplasmatischen Inhalt zur Amplifikation und Sequenzierung und half bei der Bearbeitung des Manuskripts. Prajkta S. Kallurkar half bei der Konzeption der Studie, half bei der Aufzeichnung der präBötC-Neuronen im Ganzzell-Patch-Clamp-Modus, sammelte ihren zytoplasmatischen Inhalt zur Amplifikation und Sequenzierung, führte Bioinformatik wie die Ausrichtung von Sequenzen auf mm10 durch und half auch bei der Analyse der Daten sowie das Manuskript schreiben und bearbeiten. Maria Cristina D. Picardo half bei der Konzeption der Studie, bereitete die cDNA-Bibliothek aus den Proben vor, schickte die cDNA-Bibliothek zur Sequenzierung, kuratierte die Daten, half bei der Bioinformatik und half beim Verfassen und Bearbeiten des Manuskripts. Margaret S. Saha half bei der Konzeption der Studie, dem Design und der Feinabstimmung der Versuchsprotokolle, bewertete die Qualität der Daten, half bei der Analyse auf Batch-Effekte und half beim Verfassen und Bearbeiten des Manuskripts. Gregory D. Conradi Smith half beim Entwurf und der Feinabstimmung der Bioinformatikprotokolle, bewertete die Qualität der genomangepassten Daten, half bei der Analyse auf Batch-Effekte, erstellte einige der Abbildungen und schrieb und redigierte Teile des Manuskripts. Christopher A. Del Negro half bei der Konzeption der Studie, leitete die experimentellen und bioinformatischen Bemühungen, erstellte einige der Abbildungen und schrieb das Manuskript mit CKD.

Korrespondenz mit Christopher A. Del Negro.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

David, CK, Sugimura, YK, Kallurkar, PS et al. Einzelzell-Transkriptomsequenzierung inspiratorischer Neuronen des Prä-Bötzinger-Komplexes bei neugeborenen Mäusen. Sci Data 9, 457 (2022). https://doi.org/10.1038/s41597-022-01569-y

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Eingegangen: 10. März 2022

Angenommen: 19. Juli 2022

Veröffentlicht: 30. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41597-022-01569-y

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